글: 유리 피추긴 박사, 크라이오닉스 연구소 상근 저온생물학자

올해 나는 160건의 실험을 수행할 수 있었다. 실험은 세 가지 주요 연구 과제에 집중되었다.

1. 장시간 허혈의 결과를 개선할 수 있는 화합물

단시간 허혈에 대응하는 데 흔히 사용하는 화합물 (예: 항산화제)은 뇌를 장시간(12~36시간) 저온 보관할 때 효과가 없었다. 그래서 흔히 사용하지 않는 화합물 몇 가지를 시험하기로 했다.

낮은 농도의 포름알데히드로 혈관 조각을 보존하는 방법이 있다. 나는 이른바 ‘화학적 가사 상태’를 만들 수 있는지 확인하기 위해 알데히드 계열의 화합물 세 가지를 시험했다. 시험한 물질은 포름알데히드, 아세트알데히드, 글루타르알데히드였다. 이 화합물들은 독성이 없는 매우 낮은 농도로 사용했다.

이 연구의 질문은 알데히드가 세포의 미세한 구조를 가역적으로 변화시켜 세포가 장시간 냉허혈에 더 잘 견디게 할 수 있는가 하는 것이었다. 장시간 저온 보관의 해로운 영향을 받기 쉬운 세포의 분자 구조 속 약한 결합을 알데히드가 가역적으로 ‘묶거나’ ‘고정할’ 수 있을까?

쥐의 상반신에 독성이 없는 여러 농도의 알데히드를 0°C에서 관류하고, 0°C에서 24시간 보관했다. 뇌의 생존율은 내가 평소 사용하던 해마 절편 방법으로 평가했다. 알데히드의 긍정적인 효과는 발견되지 않았다.

2. 또 다른 과제는 12CM 얼음 형성 억제제 연구였다.

21CM은 자사의 유리화 혼합액에 1% X-1000과 % Z-1000 얼음 형성 억제제를 사용한다.

나는 환자를 냉각하고 다시 가온하는 속도를 분당 0.3°C로 가정했다. 20mL의 용액을 분당 0.3°C로 −130°C까지 냉각한 뒤 다시 가온할 때, 얼음 형성 억제제 없이 유리화하는 데 필요한 CI-VM-1의 최소 임계 농도는 55%였다. 억제제가 없는 52% CI-VM-1에서는 얼음 결정이 생겼다. 얼음 형성 억제제를 사용했을 때의 최소 농도는 52%였다. 억제제를 사용한 50% CI-VM-1에서는 얼음 결정이 생겼다.

독성 시험 결과는 다음과 같았다.

독성 검사는 칼륨/나트륨 비율을 이용해 수행했다.

21CM의 억제제를 사용한 내 실험에서는 억제제가 생존에 필요한 CI-VM-1의 유효 농도를 약 3% 낮출 수 있는 것으로 나타났다. 얼음 형성 억제제는 장기 저온보존에는 가치가 있을 수 있지만, 크라이오닉스에서는 그다지 중요하지 않다.

유리화 혼합액의 농도가 3% 높아져 독성이 약간 증가하는 것보다 크라이오닉스 환자에게 더 해로운 요인은 많다. 나는 억제제가 혈액뇌장벽과 세포막을 통과하는 문제는 고려조차 하지 않았다. 동일한 효과를 얻으려면 훨씬 비싼 얼음 형성 억제제를 3% 사용하는 대신 CI-VM-1을 3% 더 사용할 수 있다.

3. 내가 수행한 중요한 연구 과제는 장시간 허혈을 겪지 않은 환자를 위한 유리화 방법이었다.

12~24시간의 냉허혈은 뇌 조직 생존율을 대조군의 40%로 낮췄다. 우리는 가능한 한 최상의 뇌 조직 저온보존 결과를 얻을 수 있도록 CI 회원을 위한 개선된 유리화 방법을 개발해야 한다. 이를 위해 무엇보다 잠재적 CI 환자는 현장 대기 팀을 준비하고, 말기 상태에 이르면 미시간으로 이동해 장시간 허혈을 피해야 한다.

뇌 전체를 저온보존할 때 가장 심각한 문제 중 하나는 유리화 혼합액을 관류하는 동안 뇌가 심하게 탈수된다는 점이다. 모든 동결보호제(CPA)는 온전한 혈액뇌장벽을 통과하는 속도가 물보다 훨씬 느리다. CPA를 관류할 때 물은 CPA가 뇌로 들어오는 속도보다 훨씬 빠르게 뇌에서 빠져나간다. 그 결과 관류 중 뇌가 심하게 탈수된다. 심한 탈수는 CPA의 독성을 극적으로 높이므로 매우 해로운 요인이다. 얇은 뇌 절편에는 CPA가 단순 확산으로 침투하기 때문에 절편은 심하게 탈수되지 않는다.

물질 X를 사용했을 때 얻을 수 있는 큰 이점을 예로 들 수 있다. 특정 조건에서 30% 에틸렌글리콜(EG)은 뇌 조직에 독성이 없다. 0°C에서 30% EG에 노출된 쥐의 해마 절편은 K/Na 비율 측정법상 생존율이 100%였다. 반면 물질 X 없이 0°C에서 30% EG를 관류한 쥐의 뇌 전체는 생존율이 약 40%에 불과했다. 뇌는 약 35% 탈수되었다. 물질 X로 쥐의 혈액뇌장벽을 변화시키자 관류 중에도 뇌의 정상 부피가 유지되었다. 그 결과 적절한 농도의 물질 X를 사용하면서 0°C에서 30% EG를 관류한 쥐의 뇌는 생존율이 100%였다!

이 과제의 핵심은 VM을 관류하는 동안 뇌가 정상 부피를 유지하도록 혈액뇌장벽을 변화시키는 것이었다. 나는 물질 X가 속한 화학물질 계열의 네 가지 하위 분류에 해당하는 화합물 12종을 연구했다. 12종 가운데 4종이 바람직한 활성을 보였다. 나는 이 물질들을 혈액뇌장벽 조절제, 즉 BBB 조절제라고 부른다.

성능이 더 좋은 조절제들을 양의 뇌에서 시험했다. 쥐의 뇌와 마찬가지로 양의 뇌도 VM 관류 중 정상 부피를 유지했다. 효과가 좋았던 조절제 네 가지 가운데 가장 우수한 하나를 장시간 허혈을 겪지 않은 환자를 위한 새로운 CI 저온보존 방법에 선택했다.

장시간 허혈을 겪은 경우에는 BBB 조절제를 사용할 이유가 없다. 허혈이 혈액뇌장벽을 손상시키므로 뇌가 심하게 탈수되지 않기 때문이다. 나는 BBB 조절제를 최적으로 사용하기 위한 냉허혈 시간의 한계를 확인했다. 냉허혈이 9시간에 이르기 전까지는 쥐와 양의 뇌에 VM을 관류할 때 가장 우수한 BBB 조절제를 정상 농도로 사용해야 한다. 냉허혈이 9시간에서 18시간 사이일 때는 조절제를 절반 농도로 사용해야 한다. 냉허혈이 18시간을 넘은 뇌에 VM을 관류할 때는 조직 부종을 일으킬 수 있으므로 BBB 조절제를 사용해서는 안 된다.

알려진 모든 저온보존 방법은 뇌 전체를 저온보존한 뒤 뇌세포 생존율이 매우 낮다. 새로운 CI 방법은 뇌세포 생존율을 상당히 높인다. 이 방법을 적절히 사용하면 뇌 전체를 저온보존한 뒤 세포의 약 80%를 보존할 수 있다. CI는 이 방법에 관한 잠정 특허 출원을 제출했다.