글: 유리 피추긴 박사, 크라이오닉스 연구소 상근 저온생물학자

올해 나는 140건의 실험을 수행할 수 있었다. 실험은 여러 연구 과제에 걸쳐 진행되었다.

1. CI에서 먼 지역으로부터 12~24시간 운송하는 동안 환자의 뇌를 보존할 수 있는지 계속 연구했다.

1.1 쥐 뇌의 온허혈과 냉허혈에 관한 연구를 마쳤다. 그 결과는 Immortalist 잡지(2006년, 제38권 제1~2호 및 제5~6호)에 발표했다. 주된 결론은 현재의 어떤 장기 보존액이나 첨가제도 뇌를 장시간 저온 보관하는 데 유용하지 않았다는 것이다. 크라이오닉스는 미래의 완전한 기술에 의존한다는 점에서 현재의 저온생물학 및 의학과 매우 다르다. 그러나 아직 불완전한 현재의 저온생물학과 의학은 허혈 손상으로부터 생물학적 조직을 회복시키기 위해 그 조직이 본래 가진 자연적·자발적 회복 능력에만 의존할 수 있다.

1.2 쥐의 뇌 전체와 K/Na 비율 측정법을 이용해 스다 박사의 실험을 계속 연구했다. 뇌에 0°C에서 글리세롤 용액 (부피 기준 5%, 10%, 15%)을 관류하고, −20°C까지 천천히 냉각한 뒤 그 온도에서 12~24시간 보관하고 글리세롤을 씻어냈다. 쥐 뇌 조직의 생존율은 내가 평소 사용하던 해마 절편 방법으로 평가했다. 조직은 죽어 있었다.

1.3 쥐의 뇌 조직을 이용해 세키 박사의 실험도 계속 연구했다. 세키 박사는 쥐의 심장을 어느 정도 탈수시켜 비수성 매질에 보관했다. 그는 1999년 학술지 Cryobiology에 쥐의 심장을 10~26일 동안 저온 보관한 뒤 보존하고 다시 살릴 수 있었다고 짧게 보고했다! 그러나 2000년부터 2006년까지 이 주제에 관한 그의 논문이나 특허 출원은 없었다.

나는 쥐의 뇌를 여러 정도로 탈수시켜 저온 보관 결과를 개선하기 위해 2.5~20% 포도당 용액을 사용해 보았다. 그러나 이러한 삼투압을 이용한 탈수는 쥐의 뇌에 해로웠다.

쥐의 해마에 세키 박사의 절차를 적용해 보기도 했다. 해마를 실리카겔과 함께 불활성 액체에 넣고 2~4°C에서 24시간 보관했다. 긍정적인 효과는 없었다.

다른 실험에서는 불활성 액체를 넣지 않은 20mL 바이알에서 쥐의 해마를 실리카겔로 여러 시간 동안 2~4°C에서 건조한 다음, 해마를 24시간 저온 보관했다. 건조를 통해 해마를 서로 다른 정도로 탈수시켰을 때 절편의 생존율에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위한 실험이었다. 이번에도 긍정적인 효과는 없었다.

스다 박사와 세키 박사의 연구 주제에 관해 내가 수행한 실험 결과를 Immortalist 잡지에 발표하고 싶다.

2. 냉허혈이 24시간 진행된 양의 뇌에 유리화 혼합액(VM)을 관류했을 때의 품질을 계속 연구했다.

대부분의 CI 환자에게 장시간(12~24시간)의 냉허혈이 발생했으므로 이는 CI에 중요한 연구다. 내 실험에서는 양의 머리를 2~4°C에서 24시간 보관한 뒤에도 VM-1 용액을 성공적으로 관류할 수 있었다! 양의 뇌는 안정적으로 유리화되었다. 우리에게 매우 중요한 긍정적 결과다. 뇌혈관이 파열되는 현상도 관찰되지 않았다.

3. 신체에 VM을 관류할 때의 문제를 연구했다. 인체 전체를 균일하고 안정적으로 유리화하려면 어떤 유리화 혼합액을 사용하든 매우 많은 양이 필요하다.

주된 문제는 소화관과 복강에 많은 양의 관류액이 축적된다는 것이었다. 이 현상의 정확한 원인은 알려져 있지 않다. 아마 그 부위의 모세혈관에서 액체가 새어 나오는 것으로 보인다. 현재로서는 환자의 신체에 유리화 혼합액을 충분히 침투시켜 전체를 균일하고 안정적으로 유리화하는 것이 불가능하다.

과거 CI 환자에게서는 복부가 조금 부풀어 오른 경우가 있었다. CI가 신체 관류에 매우 적은 양의 글리세롤 용액을 사용했기 때문이다. 어떤 때는 소량의 글리세롤 용액을 사용했는데도 복부가 더 심하게 부풀어 올랐는데, 해당 CI 환자들에게 내부 장기의 암이 있었기 때문이다.

나는 유리화가 아닌 동결 절차를 위해 환자의 신체에 에틸렌글리콜(EG) 용액을 관류하는 방법을 개발했다. 고농도 EG 용액의 점도는 글리세롤 용액보다 훨씬 낮다. EG는 글리세롤보다 조직에 더 잘 침투한다.

4. CI의 뇌 조직 유리화 저온보존 방법에 관한 특허 출원서를 작성했다.

출원을 위해 몇 가지 추가 실험을 수행해야 했다. 크라이오닉스 연구소의 유리화 혼합액(CI-VM-1)은 매우 단순하고 저렴하다. 이는 알려진 다른 유리화 혼합액과 비교했을 때 CI-VM-1의 가장 중요한 장점 중 하나다.

5. 장시간 허혈을 겪지 않은 잠재적 CI 환자를 위해 현재의 CI 유리화 방법을 개선할 가능성을 계속 연구했다.

12~24시간의 냉허혈은 뇌 조직의 생존율을 대조군의 40%로 낮췄다. 우리는 가능한 한 많은 뇌 조직을 저온보존할 수 있는 개선된 CI 유리화 방법을 회원에게 제시해야 한다. 이를 위해서는 무엇보다 잠재적 CI 환자가 장시간 허혈을 겪지 않아야 한다.

단시간 허혈에 대응하는 데 사용해 온 일반적인 화합물 (예: 항산화제)로는 뇌의 장시간(12~36시간) 저온 보관 결과를 개선할 수 없다고 생각한다. 그래서 흔히 사용하지 않는 화합물 몇 가지를 시험하기로 했다. 하지만 장시간 허혈의 결과를 개선할 수 있으리라는 기대는 크지 않다.

유해 요인 중 하나는 VM 관류 중 뇌가 과도하게 탈수되는 것이다. 이 문제의 원인은 혈액뇌장벽(BBB)이 동결보호제를 거의 통과시키지 않는다는 점이다. 이전에 보고했듯이 물질 X를 사용해 혈액뇌장벽을 열자, 쥐와 양의 뇌를 탈수 없이 VM-1로 완전히 포화시킬 수 있었다. 그러나 혈액뇌장벽을 여는 최적의 절차를 찾으려면 뇌 탈수가 뇌 조직 생존율에 미치는 영향을 계속 연구해야 한다. 이 절차는 새로운 특허 출원의 대상이 될 수도 있다.

사람의 뇌에 70% VM-1을 0°C 대신 −20°C에서 침투시키면 뇌 조직 생존율을 크게 높일 수 있을 것이다. 주된 문제는 CI-VM-1이 다른 유리화 혼합액보다 점도가 낮음에도, −20°C에서는 70% VM-1의 점도가 매우 높다는 점이다. 이 문제를 극복하기 위해 더 많은 실험을 해야 한다.

머리에 유리화 혼합액을 침투시킨 뒤 불활성 액체를 이용해 혈관을 통해 환자의 머리를 더 빨리 냉각할 수 있는지도 실험했다. 사람 머리의 모델로는 쥐와 양의 머리를 사용했다.

벤 베스트는 VM-1의 동결보호제(CPA) 농도를 낮추기 위해 트레할로스와 자당을 사용해 보자고 제안했다. 나는 당시에도 지금도 VM-1의 CPA 농도를 낮추는 데 반대한다. 그렇게 하면 뇌 유리화의 안정성이 떨어져 탈유리화와 얼음 형성이 일어날 수 있기 때문이다. 트레할로스와 자당을 사용한 나의 실험에서도 뇌 절편 유리화의 안정성이 낮아졌다. 얼음의 결정화는 매우 강력한 과정이므로 VM-1의 농도를 낮춰서는 안 된다. 나는 뇌 조직 생존율을 높일 다른 방법, 즉 VM-1의 독성에 대한 뇌 조직의 저항성을 높이는 방법을 제안한다.

CI-VM-1 동결보호제와 CI 캐리어 용액

크라이오닉스 연구소(CI)는 CI 회원의 개에게 처음으로 실험적 관류를 시행한 2004년 8월부터 저온보존 대상인 반려동물과 사람의 뇌를 유리화하는 혼합액을 사용해 왔다. 이 유리화 혼합액의 이름은 CI-VM-1(CI Vitrification Mixture One)이며, CI의 상근 저온생물학자인 유리 피추긴 박사가 개발했다. 이 혼합액의 사용이 처음 발표된 것은 2005년 2월 개 토르의 유리화 사례였다. 사람에게 처음 사용된 것은 2005년 8월 CI의 69번째 환자를 유리화했을 때였다.

크라이오닉스 연구소는 완전한 특허 출원에 앞서 2006년 8월 CI-VM-1에 관한 예비 특허 출원을 했다. 특허 출원서는 준비되었지만, 법률 자문은 예비 출원보다 1년 이상 앞서 상업적으로 사용되었기 때문에 특허를 받을 가능성이 매우 낮다고 조언했다. 다른 사람이 CI의 사용을 막지 못하도록 방어적 조치로서 CI의 유리화 용액과 캐리어 용액을 공개하라는 조언을 받았다.

크라이오닉스 연구소 환자의 최종 유리화 관류에는 피추긴 박사가 개발한 캐리어 용액에 CI-VM-1을 70%로 혼합한 용액을 사용한다. 그는 캐리어 용액을 m-RPS-2(변형 신장 보존액 2)라고 부른다. 약 8.3L의 70% CI-VM-1은 다음 성분으로 만들어진다.

70%(w/w)는 중량 대 중량으로 계산하므로 정확한 부피는 그다지 중요하지 않다.

동결보호제 약 6.3kg ÷ 전체 약 9kg = 약 70%(w/w)

캐리어 용액은 염화칼륨 28mM/L, 포도당 230mM/L, 유기 TRIS-HCl 완충액 10mM/L로 구성된다. 9배(9X) 농축 캐리어 용액 1L는 KCl(염화칼륨) 19g, 포도당 372g, Tris[2-아미노-2-(하이드록시메틸)아미노메테인] 11g과 1.0노르말 HCl(염산) 72mL를 사용해 만들며, 2마이크론 필터로 여과한다. VM-1은 여과하지 않는다.

저온생물학 연구 회사 21st Century Medicine이 측정한 CI-VM-1의 유리전이온도(Tg)는 다음과 같다.

피추긴 박사는 자신이 개발한 유리화 용액과 캐리어 용액의 조합이 강력한 유리화 능력을 제공하면서도 낮은 점도와 최소한의 비용에 잘 맞춰져 있다고 생각한다. 그는 CI의 관류 절차에서 뇌 관류 시 교질삼투압을 유지하기 위해 단백질, 덱스트란, HES, PVP 같은 고분자량 물질을 사용할 가치가 없다고 본다. 이런 물질은 점도를 높이고, 동결보호제 자체의 탈수 효과를 고려하면 필요하지 않다고 생각하기 때문이다. 실제로 CI는 CI-VM-1과 m-RPS-2를 사용해 뇌를 관류할 때 심한 뇌부종이나 교질삼투압 유지가 필요한 상황을 많이 보지 못했다.

피추긴 박사는 Ca²⁺, Mg²⁺, 인산 이온, 무기 완충액 같은 첨가제를 캐리어 용액에 넣으면 낮은 온도에서 CI-VM-1과 캐리어 용액의 혼합액에 침전물이 생기고, 관류 중 혈관을 막을 수 있음을 관찰했다. 이런 이유로 해당 물질들은 그의 캐리어 용액에 포함되지 않는다.

피추긴 박사는 CI-VM-1에 첨가했을 때의 잠재적 이점을 알아보기 위해 21st Century Medicine의 얼음 형성 억제제(Supercool X-1000과 Supercool Z-1000)를 평가했다.

먼저 얼음 형성 억제제를 사용하지 않고 분당 0.3°C의 속도로 −130°C까지 냉각한 뒤 다시 가온했을 때, 유리화에 필요한 CI-VM-1의 최소 임계 농도가 55%임을 확인했다. 억제제가 없는 52% CI-VM-1에서는 얼음 결정이 형성되었다.

다음으로 얼음 형성 억제제를 사용하면서 동일하게 분당 0.3°C의 속도로 −130°C까지 냉각한 뒤 다시 가온했을 때, 유리화에 필요한 CI-VM-1의 최소 임계 농도가 52%임을 확인했다. 억제제가 포함된 50% CI-VM-1에서는 얼음 결정이 형성되었다.

얼음 형성 억제제를 사용해 더 낮은 농도의 CI-VM-1로 동일한 수준의 유리화를 이룰 수 있다면, 동결보호제 농도가 낮아지면서 독성도 줄어 생존 능력이 높아질 것이다. 얼음 형성 억제제는 동결보호제와 달리 독성이 없는 것으로 여겨진다.

얼음 형성 억제제의 사용 여부에 따른 CI-VM-1의 독성을 시험하기 위해 해마 절편에 0°C와 −7°C에서 점차 높아지는 농도의 에틸렌글리콜을 침투시켰다. 이어 −20°C까지 냉각해 얼음 형성 억제제가 포함되거나 포함되지 않은 CI-VM-1을 10분 동안 침투시켰다. CI-VM-1에 들어 있는 DMSO는 낮은 온도에서 독성이 적으며, −20°C에서 주입했을 때 독성이 가장 적다. 먼저 에틸렌글리콜을 넣고 분당 0.3°C로 냉각함으로써, CI-VM-1을 주입할 때 용액이 −20°C에서 얼지 않도록 했다.

독성 시험 결과는 다음과 같다.

독성 검사는 칼륨/나트륨 비율을 이용해 수행했다. 완전한 생존 능력, 즉 독성이 없는 상태는 100%에 해당한다. 다시 말하지만 이는 얼음 형성 억제제의 사용 여부에 따른 CI-VM-1의 동결 방지 능력을 시험한 결과가 아니다.

피추긴 박사는 얼음 형성 억제제를 CI-VM-1 조성에 추가했을 때 나타나는 생존 능력의 작은 증가가 점도나 비용 증가를 정당화하지 못한다고 생각한다. 특히 얼음 형성 억제제는 세포막이나 혈액뇌장벽을 통과할 수 없다는 점을 고려해야 한다. 뇌의 어떤 부위에 관류가 매우 부족하다면 억제제도 도움이 되지 않는다. 억제제로 인해 점도가 높아져 관류가 줄어든다면 억제제의 이점도 줄어든다. 세포 안에는 얼음 결정의 핵이 될 물질이 적으므로 세포 내 동결은 그리 큰 문제가 아니다. 하지만 세포 사이의 간질액에는 혈액 속만큼 많은 결정 핵이 있을 수 있다. 따라서 얼음 형성 억제제가 혈액뇌장벽을 통과하지 못한다는 사실은 관류가 부족한 부위에 기대한 이점도 그리 크지 않을 수 있음을 뜻한다.

크라이오닉스 연구소는 비용을 매우 낮게 유지하는 데 도움이 되는 산업용 등급 동결보호제를 사용한다. 산업용 등급이지만 순도는 여전히 높다. 주된 불순물은 물이다. 물에 오염되지 않은 화학물질이 필요한 연구실에는 적합하지 않을 수 있지만, CI는 어차피 동결보호제 혼합액에 물을 추가하므로 물이 ‘불순물’이라는 점은 문제가 되지 않는다. DMSO의 순도는 99.7%이며, 표시된 불순물은 물, ‘색도’ 및 적정 가능한 산 (0.001밀리당량/g)뿐이다. 에틸렌글리콜의 순도는 99.94%이고 주된 불순물은 역시 물로, 약 0.06%다. 에틸렌글리콜에서 그다음으로 많은 불순물은 아세트산(<0.001%)과 회분(0.0005%)이다. 염화물, ‘색도’, 디에틸렌글리콜 및 철은 에틸렌글리콜에 백만분율(ppm) 수준으로 존재한다.

크라이오닉스 연구소가 환자의 머리, 즉 뇌에 관류할 때 사용하는 절차는 다음과 같은 4단계의 개방 회로 관류다.

1. 캐리어 용액으로 혈액 세척 (4°C)
2. 10% 에틸렌글리콜 (4°C)
3. 30% 에틸렌글리콜 (4°C)
4. 70% CI-VM-1 (−7°C)