유리 피추긴 박사 작성

(다음 내용은 연구의 여러 단계에 관한 별도의 보고서들을 종합한 것이다. 마지막 보고서는 1998년 5월에 받았다. 편집이나 번역에 결함이 있다면 그것은 우리 책임이다. 덧붙여 살아 있는 동물을 대상으로 한 실험은 없었다. 마취 후 안락사시킨 고양이들은 어떤 경우에도 안락사될 예정이었다.)

내가 고양이 머리를 연구하는 목적은 다음과 같다.

1. 균열이 발생하는 한계를 결정한다.
2. 균열로 인한 냉동 손상의 기전을 연구한다.
3. 글리세롤, DMF 및 다른 냉동보호제(CPA)의 균열 방지 효과를 비교한다.
4. 냉동보호제를 관류하고 재관류하는 가장 효과적인 절차를 찾는다.
5. 고양이 머리 실험의 가장 중요한 결과를 양 머리와 두개골에서 검증한다. 또한 루빈스키 방정식의 보정 내용을 확인하고 가능하다면 개선한다.
6. 최적의 냉동보호제와 냉동보존 방법을 찾고 고양이 뇌 절편을 이용해 검증한다.
7. 고양이와 양 뇌의 균열 한계 측정 결과를 이용해 인간 뇌의 균열 한계를 더 정교하게 계산한다.

양 뇌에서 고양이 뇌로 연구 대상을 바꾼 것은 양보다 고양이를 구하기 쉽고, 사망 후 짧은 시간 안에 고양이 뇌를 연구할 수 있기 때문이다. 이는 특히 뇌 절편 배양 연구에 필요하다. 여기에서 보고하는 연구의 목적은 보호제를 처리하지 않은 고양이 뇌와 냉동보호제인 DMF(디메틸포름아미드) 또는 글리세롤을 관류한 고양이 뇌에서 냉각·해동 방식이 형태학적 구조에 미치는 영향을 조사하는 것이었다.

재료 및 방법

여기에는 모든 고양이 뇌에 공통으로 적용한 일반적인 방법만 설명한다. 실험에는 몸무게 2.6~3.6kg의 암수 고양이를 사용했다. 먼저 에테르로 마취한 다음 헥사날룸 200mg/kg을 근육주사했다. 20~30분 후 깊은 전신마취를 위해 150mg/kg을 정맥주사했다. 머리를 냉동보호제 관류에 사용하지 않는 경우에는 마취 상태에서 매우 날카로운 칼로 목을 신속하게 절단했다. 냉동보호제 관류에 사용하는 경우에는 경정맥만 절단했다. 그 5분 전에 경정맥으로 헤파린 700단위/kg을 투여했다.

혈액을 씻어내기 위해 둘째 척추 높이에서 캐뉼라를 삽입한 경동맥을 통해 헤파린 10단위/mL가 들어 있는 타이로드 용액 0.5L를 주입했다. 원문에서 양이 사망한 시점부터 머리 조직의 혈액 세척을 시작한 시점까지의 시간은 사실상 없었다고 기록했다. 세척 용액의 주입 속도는 약 40mL/분이었다. 이어서 고양이 머리에 저농도 DMF(타이로드 용액에 섞은 20% DMF) 또는 타이로드 용액에 섞은 20% 글리세롤을 관류했다. 모든 용액은 분석용 등급의 화학물질로 제조했고 온도는 실온인 25°C였다. 관류 후 머리를 둘째 척추 높이에서 절단했다.

더 빠른 냉각·해동 속도를 얻기 위해 고양이 두개골 주위의 조직과 뼈를 모두 제거했다. 그런 다음 머리 또는 두개골을 알루미늄 포일로 감싸 액체질소(LN₂)에 곧바로 빠르게 담갔다. 온도는 구리·콘스탄탄 열전대로 측정했다. 두개골은 +40°C 수조에서 해동했다. 해동 후 뇌 전체에서 냉동보호제를 제거하는 재관류는 하지 않았다. 해동한 다음 검사할 뇌를 적출했다. 전두엽 조직 일부는 조직학 표본에 사용하고, 대뇌반구 뒤쪽 조직 일부는 냉동보호제 농도를 측정하는 데 사용했다. 뇌의 백질과 회백질, 씹기근, 혀를 포함한 머리 조직의 글리세롤 농도는 이전에 The Immortalist 1994년 제25권 제8호 5쪽에 설명한 방법으로 측정했다. (조직과 세포의 냉동보호제 농도 측정에 관해서는 별도의 글을 쓸 예정이다.) 고양이 뇌 조직 조각에서는 냉동보호제를 씻어내지 않았다. 냉동보호제가 들어 있는 조직은 보호제를 첨가한 10% 중성 포르말린에 고정했다.

결과 및 논의

(냉각·가온 방식을 설명하기 전에 그림 1과 2를 예로 들어 평균 속도에 관한 정보를 제시하겠다. 그림 1과 2는 양 두개골을 다룬 내 글, The Immortalist 1997년 제3/4호 48~50쪽과 관련된다. 그림에 ‘양 두개골’ 대신 ‘양 머리’라고 적은 점은 미안하게 생각한다. 그림의 평균 속도와 그 글 49쪽의 속도를 비교하면 그림 1과 2의 평균 속도가 냉각·가온 곡선을 더 정확하게 반영한다는 것을 알 수 있다. 따라서 아래에서는 냉각·가온 곡선에서 대체로 직선에 가까운 부분의 평균 속도를 이용해 각 방식을 설명하겠다. 냉각·가온 방식에 관한 모든 자료는 펜티엄 133 컴퓨터로 처리하고 그래프로 나타냈다. 이는 내 연구에 매우 유용했다.)

연구를 시작하면서 고양이 머리와 두개골의 최대 냉각·가온 속도를 조사했다. 해동한 고양이 뇌에 육안으로 보이는 큰 균열이 있는지도 확인했다.

보고서의 요약 내용은 다음과 같다.

실험 1.1

몸무게 3.3kg인 고양이의 보호제를 처리하지 않은 머리(295g)를 액체질소 표면 위에서 냉각하고 +40°C 수조에서 가온했다. 입천장에 둔 첫 번째 열전대(tc1)는 −5°C에서 −106°C까지 0.51°C/분, −106°C에서 −145°C까지 0.43°C/분, −196°C까지 약 0.27°C/분의 냉각 속도를 보였다. 둘째 척추의 구멍에서 약 5cm 떨어진 곳, 즉 뇌의 중간 부근에 둔 두 번째 열전대(tc2)는 −5°C에서 −10°C까지 0.67°C/분, −100°C에서 −145°C까지 0.51°C/분, −196°C까지 약 0.30°C/분을 기록했다. −196°C에서 −50°C까지의 가온 속도는 tc1에서 8.8°C/분, 같은 온도 구간의 tc2에서 8.4°C/분이었다.

실험 1.2

같은 고양이 머리를 이번에는 액체질소에 직접 담가 냉각했다. tc1의 냉각 속도는 −13°C에서 −116°C까지 27.0°C/분, −116°C에서 −166°C까지 9.14°C/분, −196°C까지 2.05°C/분이었다. tc2에서는 −6°C에서 −151°C까지 20.3°C/분, −151°C에서 −186°C까지 5.50°C/분이었다. 머리를 +40°C에서 가온했을 때 tc1은 −196°C에서 −50°C까지 21.4°C/분, −50°C에서 −18°C까지 0.94°C/분, 0°C까지 0.30°C/분이었다. tc2는 −196°C에서 −37°C까지 16.5°C/분, −37°C에서 −7.5°C까지 1.0°C/분, 0°C까지 0.14°C/분이었다. 이 머리의 뇌에는 매우 심한 균열이 생겼다. 포르말린에 고정하거나 사진을 찍지는 않았다.

실험 2: 20% 글리세롤을 관류한 고양이 머리와 두개골의 예비 실험

고양이의 몸무게는 약 4.0kg, 머리는 307g, 두개골은 53g이었다. 열전대 1과 2의 위치는 실험 1.1과 같았다.

실험 2.1

머리를 액체질소에 담가 냉각했을 때 속도는 tc1에서 −12°C부터 −176°C까지 3.5°C/분, 같은 온도 구간의 tc2에서 4.6°C/분이었다. +40°C에서 해동했을 때 tc1은 −196°C에서 −80°C까지 14.1°C/분, −24°C까지 4.0°C/분이었고, tc2는 −196°C에서 −65°C까지 8.7°C/분, −24°C까지 3.0°C/분이었다. (이 방식은 앞서 보낸 그림 3과 4에 제시했다. 그림 5에 ‘20% 글리세롤을 관류한 고양이 머리’ 대신 ‘보호제를 처리하지 않은 고양이 머리’라고 적은 점은 미안하게 생각한다.) 실험 1.2의 무처리 머리에서 나타난 냉각·가온 속도는 이 실험의 글리세롤 처리 머리보다 느렸다.

실험 2.2

고양이 머리의 두개골을 액체질소에 담가 −90°C까지만 냉각하고 +40°C에서 해동했다. 열전대 1은 두개골 바닥 부분에서 조직 1~2mm 아래에 두었다. tc2는 첫째 목뼈의 구멍에서 약 2.5cm 떨어진 곳에 두었다. 이후 모든 고양이 두개골 실험에서 같은 탐침 위치를 사용했다.

실험 2.2.1

tc1의 냉각 속도는 −4°C에서 −72°C까지 22.7°C/분이었다. tc2는 −12°C에서 −65°C까지 24.7°C/분, −65°C에서 −88°C까지 5.5°C/분이었다. tc1이 −72°C에 도달했을 때 뇌의 온도가 −90°C 아래로 내려가지 않도록 두개골을 액체질소에서 신속히 꺼냈다가 다시 담그고 또 꺼냈다. tc2가 −90°C에 도달했을 때에는 액체질소 표면 위의 온도가 −90°C인 높이에 두개골을 놓고 15~20분 유지했다. 액체질소 표면 위의 각 높이에서 온도를 정확히 측정한 높은 원통형 진공 플라스크에서 두개골을 냉각했다. 원문에 기록된 유리 용기의 높이는 1200cm, 지름은 100cm다. 두개골을 +40°C에서 가온했을 때 tc1의 속도는 −90°C에서 −36°C까지 37.6°C/분, −36°C에서 −12°C까지 7.4°C/분이었다. tc2는 −90°C에서 −37°C까지 15.3°C/분, −37°C에서 −18°C까지 6.3°C/분이었다.

실험 2.2.2

같은 두개골로 실험 2.2.1을 반복했다. tc1의 냉각 속도는 −5°C에서 −36°C까지 73.8°C/분, −36°C에서 −97°C까지 21.1°C/분이었다. tc2에서는 −5°C에서 −12°C까지 약 2.0°C/분, −12°C에서 −37°C까지 33.3°C/분, −37°C에서 −65°C까지 62.2°C/분, −65°C에서 −80°C까지 27.0°C/분, −80°C에서 −90°C까지 6.3°C/분이었다. 가온 속도는 tc1에서 −90°C에서 −24°C까지 23.8°C/분, −24°C에서 −4°C까지 4.8°C/분이었다. tc2에서는 −90°C에서 −30°C까지 20.7°C/분, −30°C에서 −18°C까지 5.7°C/분, −18°C에서 0°C까지 1.24°C/분이었다. 자동 프로그램이 아닌 수동 제어로는 냉각·가온 방식을 재현하는 정도가 상당히 좋지 않았다. (무게가 약 1g인 쥐 심장의 냉각 방식을 수동으로 재현하는 일은 훨씬 더 어렵다.)

실험 2.3

같은 두개골을 −196°C까지 두 번 냉각하고 다시 가온했다.

실험 2.3.1

tc1의 냉각 속도는 −5°C에서 −50°C까지 108.0°C/분, −50°C에서 −176°C까지 22.5°C/분, −176°C에서 −196°C까지 5.0°C/분이었다. tc2에서는 −5°C에서 −18°C까지 11.1°C/분, −18°C에서 −123°C까지 53.9°C/분, −123°C에서 −176°C까지 24.4°C/분, −176°C에서 −196°C까지 6.10°C/분이었다. 가온 속도는 tc1에서 −196°C에서 −80°C까지 114.0°C/분, −80°C에서 −42°C까지 30.0°C/분, −42°C에서 −6°C까지 8.72°C/분이었다. tc2에서는 −196°C에서 −65°C까지 49.1°C/분, −65°C에서 −43°C까지 20.4°C/분, −43°C에서 −10°C까지 5.28°C/분이었다.

실험 2.3.2

실험 2.3.1을 반복했다. 원문에 기재된 tc1의 속도는 −4°C에서 −176°C까지 26.2°C/분, −176°C에서 −50°C까지 5.76°C/분, −50°C에서 −12°C까지 9.5°C/분이었다. tc2의 속도는 −196°C에서 −50°C까지 44.5°C/분, −50°C에서 −18°C까지 7.7°C/분이었다. 두개골을 액체질소에 신속히 담그는 방법은 재현성이 상당히 좋았다. 이 머리의 뇌에는 실험 1의 뇌와 마찬가지로 매우 심한 균열이 생겼다. 포르말린에 고정하거나 사진을 찍지는 않았다.

실험 3: 글리세롤을 처리한 고양이 머리를 −90°C까지 냉각

몸무게 3.8kg인 고양이의 글리세롤 처리 머리(274g)를 액체질소 표면 위에서 −90°C까지 냉각한 다음 +40°C에서 가온했다. tc1과 tc2의 냉각 속도는 모두 −16°C에서 −80°C까지 3.0°C/분이었다. 아래에서는 이 온도 구간을 ‘16~80’처럼 줄여 쓴다. −80°C에서 −90°C까지의 냉각 속도는 0.9°C/분이었다. tc1의 가온 속도는 −90°C에서 −32°C까지 3.8°C/분, −32°C에서 −18°C까지 1.3°C/분, −18°C에서 0°C까지 0.38°C/분이었다. tc2는 −90°C에서 −37°C까지 3.3°C/분, −37°C에서 −18°C까지 1.2°C/분, −18°C에서 0°C까지 0.25°C/분이었다. 사진 1.1~1.3은 가온과 고정 후의 뇌를 보여 준다.

아래의 사진에서 .1은 뇌의 윗면, .2는 아랫면, .3은 뇌 내부의 큰 균열을 확인하기 위해 뇌를 세로 방향으로 2~3개로 자른 절편을 보여 준다. 모든 뇌는 페트리 접시 위에 놓여 있다. 냉동보호제를 관류한 뇌에서는 해동 후 대뇌반구 뒤쪽 일부를 잘라 보호제 농도 측정에 사용했다. 그다음 10% 포르말린에 뇌를 고정했다. 고정 후 윗면과 아랫면을 촬영하고 전두엽 일부를 잘라 조직학 표본을 만들었다. 그 뒤에야 뇌를 절편으로 잘라 촬영했다. 사진에서 번호가 적힌 쪽이 위쪽이다.

사진 1.1은 글리세롤을 처리한 뇌의 앞쪽에서 본 윗면이다. 큰 균열은 없다. 양쪽 대뇌반구 사이의 큰 중앙 고랑이 뚜렷이 보인다. 사진 1.2는 역시 앞쪽에서 본 아랫면이며, 여기에도 큰 균열은 없다. 보호제 농도를 측정하기 위해 대뇌반구 뒤쪽 일부를 떼어 냈다.

사진 1.3은 큰 균열이나 큰 파열이 없는 뇌의 세 세로 절편을 보여 준다. 미세균열을 조직학적으로 검사하기 위해 전두엽 일부를 떼어 냈다. 왼쪽 절편에서 보이는 ‘빈 공간’은 균열이 아니다. 큰 균열은 아래에서 보듯 특징적인 모습을 띤다. 여기 보이는 것은 뇌의 주름과 다른 거시 구조의 경계다. 오른쪽 절편에는 흰색으로 칠한 것 같은 반점이 보이지만 실제로 칠해진 것이 아니라 사진 플래시가 만든 빛이다. 사진 1.1~1.3의 뇌는 냉동보존 상태가 가장 좋았던 사례 중 하나다.

실험 4: 보호제를 처리하지 않은 고양이 머리를 −90°C까지 냉각

몸무게 3.8kg인 고양이의 머리 무게는 314g이었다. 머리에서 혈액은 씻어 냈지만 냉동보호제는 관류하지 않았다. 머리를 −90°C로 냉각한 메틸셀로솔브 수조에 담가 냉각하고 +40°C 수조에서 해동했다. 이 실험에서는 tc2만 사용했다. 냉각 속도는 −8°C에서 −64°C까지 1.3°C/분, −64°C에서 −90°C까지 0.33°C/분이었다. 가온 속도는 −90°C에서 −19°C까지 3.8°C/분, −19°C에서 −10°C까지 1.1°C/분, −10°C에서 0°C까지 0.2°C/분이었다.

사진 2.1~2.3은 고정한 뇌를 보여 준다. 사진 2.1의 뇌에는 보통 제거하는 경막이 남아 있다. 사진 2.2는 뇌 뒤쪽에서 본 아랫부분이다. 고양이의 소뇌는 양의 소뇌와 달리 두개골의 별도 공간에 자리하므로, 모든 경우 고양이 뇌를 소뇌 없이 꺼냈다. 소뇌까지 함께 두개골에서 꺼내는 것은 매우 복잡하고 어렵다. 사진 2.2에는 열전대 2의 끝이 지나간 구멍이 보인다. 사진 2.3에서는 윗면과 아랫면뿐 아니라 뇌 내부에도 큰 균열이 없다. 왼쪽 위 절편에서 보이는 중앙 고랑은 균열이 아니다. 글리세롤을 쓰지 않은 이 뇌도 실험 3의 글리세롤 처리 뇌만큼 잘 냉동보존되었다.

실험 5: 더 빠른 속도로 −90°C까지 냉각

더 가혹한 조건에서 큰 균열이 생기는지 확인하기 위해 고양이 뇌를 더 빠른 속도로 냉각하되 최저 온도는 역시 −90°C로 했다. 고양이는 2.2kg, 두개골은 49g이었다. 실험 2.2와 같은 방식으로 보호제를 처리하지 않은 두개골을 액체질소에 직접 담가 −90°C까지만 냉각했다. tc1의 냉각 속도는 0°C에서 −80°C까지 32.4°C/분이었다. tc2는 −10°C에서 −50°C까지 22.6°C/분, −50°C에서 −78°C까지 8.6°C/분, −78°C에서 −90°C까지 1.2°C/분이었다. 가온 속도는 tc1에서 −90°C에서 −65°C까지 27.0°C/분, −65°C에서 −24°C까지 19.1°C/분, −24°C에서 0°C까지 6.3°C/분이었다. tc2에서는 −90°C에서 −18°C까지 13.0°C/분, −18°C에서 −4°C까지 2.8°C/분이었다. 이 속도는 대체로 실험 2.2와 비슷했지만 실험 3과 4보다는 훨씬 빨랐다.

사진 3.1~3.3에는 뚜렷한 큰 균열이 없는 고정된 뇌가 보인다. 그러나 사진 3.3의 아래쪽 절편에는 중앙 고랑이 이어지면서 생긴 파열이 있을 가능성이 있다. 균열 여부에 대한 최종 결론은 이 뇌의 조직학 표본을 검사한 뒤에야 내릴 수 있다. 뇌에서 혈액을 씻어 내지 않았지만 혈관은 보이지 않았다. 포르말린에 1~1.5개월 보관하는 동안 헤모글로빈이 색을 잃었기 때문이다.

실험 6: 글리세롤 처리 머리를 −196°C까지 냉각

고양이는 3.2kg, 글리세롤 처리 머리는 328g이었다. tc1의 냉각 속도는 −24°C에서 −183°C까지 4.0°C/분, −183°C에서 −196°C까지 0.73°C/분이었다. tc2에서는 −16°C에서 −183°C까지 4.7°C/분, −183°C에서 −196°C까지 0.65°C/분이었다. 가온 속도는 tc1에서 −196°C에서 −42°C까지 9.3°C/분, −42°C에서 −30°C까지 3.5°C/분, −30°C에서 0°C까지 0.84°C/분이었다. tc2에서는 −196°C에서 −50°C까지 8.0°C/분, −50°C에서 −37°C까지 4.0°C/분, −37°C에서 0°C까지 0.71°C/분이었다. 속도는 실험 2.1과 매우 비슷했다.

사진 4.1~4.3은 이 실험에서 고정한 뇌를 보여 준다. 원문에서 사진 3.1~3.2라고 지칭한 사진에는 뇌의 혈액이 매우 잘 씻겨 나갔고 표면에 큰 균열이 없는 모습이 보인다. 그러나 표면에 균열이 없다고 해서 내부에도 없는 것은 아니다. 원문에서 사진 3.3이라고 지칭한 절편에는 화살표로 표시한 몇 개의 큰 균열이 있다. 사진 아래쪽의 뇌 윗부분은 중앙 고랑을 따라 두 반구로 갈라졌다. 사진 왼쪽 위의 뇌 중간 부분에는 중앙 고랑이 이어진 큰 균열 또는 파열이 있어 절편이 거의 둘로 나뉘었다. 오른쪽 위의 아래쪽 뇌 부분에도 같은 파열이 있다. 따라서 이 냉각·가온 방식은 글리세롤 처리 고양이 뇌에서 큰 균열을 막지 못했다.

실험 7: 보호제를 처리하지 않은 두개골을 −196°C까지 냉각

고양이는 3.7kg, 두개골은 77g이었다. tc1의 냉각 속도는 0°C에서 −88°C까지 33.1°C/분, −88°C에서 −144°C까지 14.6°C/분, −144°C에서 −176°C까지 9.6°C/분, −176°C에서 −196°C까지 2.1°C/분이었다. tc2에서는 −12°C에서 −123°C까지 32.0°C/분, −123°C에서 −176°C까지 13.8°C/분, −176°C에서 −196°C까지 2.7°C/분이었다. 가온 속도는 tc1에서 −196°C에서 −115°C까지 133°C/분, −115°C에서 −58°C까지 50.9°C/분, −58°C에서 −24°C까지 21.5°C/분, −24°C에서 0°C까지 4.9°C/분이었다. tc2에서는 −196°C에서 −56°C까지 33.1°C/분, −56°C에서 −24°C까지 12.4°C/분, −24°C에서 −12°C까지 4.7°C/분이었다. 두개골의 무게는 이번이 77g, 실험 2.3이 53g이었으며, 기록된 속도는 전반적으로 실험 2.3보다 약간 느렸다.

사진 5.1~5.3은 해동과 고정 후의 뇌다. 사진 5.1에서는 혈액을 씻지 않은 뇌의 헤모글로빈 색이 30~50% 사라진 것을 볼 수 있다. 윗면에는 큰 균열이 없다. 아랫면 오른쪽에는 작은 균열이 있다. 원문에서 사진 3.3이라고 지칭한 사진에는 뚜렷한 큰 균열이 보이지만 뇌가 여러 조각으로 분리되지는 않았다. 균열은 중앙 고랑을 따라 난 것이 아니라 그 고랑을 가로질러 있다.

실험 8: −90°C에서 −196°C 구간의 속도를 늦춰 냉각·가온

고양이는 2.7kg, 보호제를 처리하지 않은 두개골은 47.4g이었다. 높은 진공 플라스크에서 냉각·가온했다(실험 2.2 참조). 처음에는 두개골을 약 1분 동안 액체질소에 빠르게 담갔다. 그다음 꺼냈다가 tc2가 −80°C를 나타낼 때까지 다시 액체질소에 담갔다. 이후 액체질소 표면 위의 −90°C 위치에 몇 분간 둔 다음 낮은 속도로 −196°C까지 냉각했다.

tc1에서 기록한 속도는 15°C에서 −88°C까지 84°C/분, −88°C에서 −65°C까지 가온 8.0°C/분, −65°C에서 −100°C까지 냉각 17°C/분, −100°C에서 −90°C까지 가온 8.0°C/분, −90°C에서 −107°C까지 0.2°C/분, −107°C에서 −166°C까지 0.3°C/분, −166°C에서 −196°C까지 0.87°C/분이었다. tc2에서는 5°C에서 −50°C까지 18.2°C/분, −50°C에서 −56°C까지 5.4°C/분, −56°C에서 −78°C까지 17.1°C/분, −78°C에서 −88°C까지 5.0°C/분, −88°C에서 −107°C까지 0.19°C/분, −107°C에서 −166°C까지 0.28°C/분, −166°C에서 −196°C까지 0.87°C/분이었다. −196°C에서 −175°C까지의 가온 속도는 tc1과 tc2 모두 0.96°C/분, −175°C에서 −80°C까지는 0.32°C/분이었다. 액체질소 표면 위에서 두개골을 −80°C까지 가온한 후 +40°C 수조를 사용했다. 이때 tc1은 −80°C에서 −50°C까지 48°C/분, −50°C에서 −18°C까지 13.1°C/분이었고, tc2는 −80°C에서 −65°C까지 35°C/분, −65°C에서 −18°C까지 11.0°C/분이었다.

사진 6.1~6.3에는 혈관이 보이지만 헤모글로빈이 분해되고 있는 고정 뇌가 나타난다. 윗면에는 큰 균열이 없다(사진 6.1). 사진 6.2에는 tc2의 끝이 지나간 구멍이 있는 뒤쪽 부분이 보이지만 큰 균열은 없다. 그러나 뇌 내부에서는 몇 개의 균열이 발견되었다(사진 6.3). 이 뇌는 실험 5의 뇌보다 약간 상태가 좋아 보였다. 그렇지만 −196°C에서 −90°C 사이에서 이처럼 느린 속도를 사용해도 무처리 뇌의 큰 균열을 막지는 못했다.

실험 9: 원문에 명시된 느린 구간을 적용한 무처리 머리의 냉각·가온

고양이는 2.5kg, 머리는 212g이었다. 원문은 0°C에서 −90°C까지의 구간을 더 느리게 했다고 설명한다. 기록된 tc1 냉각 속도는 −18°C에서 −144°C까지 6.2°C/분, −144°C에서 −181°C까지 2.27°C/분, −181°C에서 −196°C까지 0.39°C/분이었다. tc2에서는 −18°C에서 −148°C까지 6.9°C/분, −148°C에서 −181°C까지 1.83°C/분, −181°C에서 −196°C까지 0.35°C/분이었다. 가온 속도는 tc1에서 −196°C에서 −106°C까지 16.0°C/분, −106°C에서 −50°C까지 7.4°C/분, −50°C에서 −12°C까지 2.8°C/분이었다. tc2에서는 −196°C에서 −100°C까지 14.1°C/분, −100°C에서 −50°C까지 7.4°C/분, −50°C에서 −12°C까지 2.78°C/분이었다.

사진 7.1~7.3에는 혈관이 뚜렷이 보이는 고정 뇌가 나타난다. 뇌를 고정하기 시작한 때부터 사진 촬영까지 2주 동안 헤모글로빈의 색이 잘 유지되었다. 이 뇌의 형태학적 구조는 실험 8의 뇌와 매우 비슷하다. 따라서 실험 8과 비교할 때 냉각·가온 방식이 무처리 뇌에 눈에 띄는 영향을 주지는 않았다.

실험 10: DMF를 관류한 고양이 머리의 냉각·가온

머리의 무게는 400g이었고, 이 실험에서는 열전대 2만 사용했다. 냉각 속도는 0°C에서 −18°C까지 4.6°C/분, −18°C에서 −128°C까지 18.2°C/분, −128°C에서 −177°C까지 6.58°C/분, −177°C에서 −196°C까지 1.12°C/분이었다. 가온 속도는 −196°C에서 −73°C까지 15.2°C/분, −73°C에서 −43°C까지 6.7°C/분, −43°C에서 −10°C까지 2.6°C/분이었다. 이 속도는 글리세롤을 사용한 유사 실험 6보다 빨랐다.

사진 8.1~8.3은 고정된 뇌를 보여 준다. 윗면에는 큰 균열이 없었다(사진 8.1). 사진 8.2는 주로 큰 균열이 있는 뇌의 뒤쪽 부분을 보여 주지만, 아랫면에는 눈에 띄는 균열이 없다. 뇌 중간 부분에는 실험 6의 글리세롤 처리 뇌보다 큰 균열이 더 많았다. 전반적으로도 이 뇌의 상태가 더 나빠 보였다.

실험 11: DMF를 관류한 고양이 두개골의 냉각·가온

두개골 무게는 61.4g이었다. tc1의 냉각 속도는 −24°C에서 −50°C까지 10.8°C/분, −50°C에서 −178°C까지 21.3°C/분, −178°C에서 −196°C까지 3.13°C/분이었다. tc2는 −6°C에서 −176°C까지 17°C/분, −176°C에서 −196°C까지 3.85°C/분이었다. 가온 속도는 tc1에서 −196°C에서 −133°C까지 57°C/분, −133°C에서 −80°C까지 22.7°C/분, −80°C에서 −42°C까지 13.1°C/분, −42°C에서 −12°C까지 4.6°C/분이었다. tc2에서는 −196°C에서 −162°C까지 40°C/분, −162°C에서 −78°C까지 23.5°C/분, −78°C에서 −50°C까지 13.5°C/분, −50°C에서 −18°C까지 4.7°C/분이었다.

사진 9.1~9.3에는 고정 뇌가 나타난다. 이 냉동보호제 관류 뇌는 이유가 분명하지 않지만 유사한 실험 7의 무처리 뇌보다도 상태가 나빠 보였다. 윗면에조차 중앙 고랑을 가로지르는 큰 균열이 있었다(사진 9.1). 아랫면에도 큰 균열이 몇 개 있었다(사진 9.2). 뇌 절편 하나는 여러 조각으로 부서졌다(사진 9.3).

실험 12: DMF를 관류한 두개골을 더 느리게 가온

두개골 무게는 61.8g이었다. tc1의 냉각 속도는 −5°C에서 −80°C까지 44°C/분, −80°C에서 −176°C까지 19.9°C/분, −176°C에서 −196°C까지 4.5°C/분이었다. tc2에서는 −24°C에서 −176°C까지 35°C/분, −176°C에서 −196°C까지 2.3°C/분이었다. 이는 실험 11보다 빠른 냉각 속도였다. 가온 속도는 두 열전대 모두 −196°C에서 −155°C까지 0.25°C/분, −155°C에서 −133°C까지 0.5°C/분, −133°C에서 −72°C까지 1.0°C/분이었다. 그 뒤 +24°C 공기 중에서 가온했다. tc1은 −72°C에서 −42°C까지 5.34°C/분, −42°C에서 −10°C까지 2.56°C/분이었다. 원문의 tc2 기록은 ‘−72°C에서 −73°C까지 4.15°C/분’과 ‘−37°C에서 −10°C까지 2.03°C/분’이다.

사진 10.1~10.3에서 이 뇌는 앞선 실험의 뇌보다 상당히 나아 보였다. 윗면에는 큰 균열이 없었고(사진 10.1), 아랫면에는 균열이 하나만 있었다(사진 10.2). 뇌 중간 부분에는 실험 8과 마찬가지로 큰 균열이 있었다(사진 10.3; 원문에서는 사진 6.3도 참조). 가온 속도를 늦추면 뇌의 냉동보존 상태가 어느 정도 개선되었다.

따라서 현재까지는 낮은 냉동보호제 농도와 빠른 속도라는 까다로운 뇌 냉동보존 조건에서 DMF의 특별히 뛰어난 성질이 발견되지 않았다. 다음 실험에서는 더 느린 속도와 더 높은 보호제 농도라는 수월한 조건에서 DMF와 글리세롤의 냉동보호 효과를 비교할 예정이다.

고양이 뇌 실험 3~6 및 12의 조직학 평가

앞서 보고했듯 −90°C까지 냉각한 실험 3~5의 고양이 뇌에는 큰 균열이 없었다. 그래서 미세균열이 있는지 확인하기 위한 조직학 표본을 만들었다. −196°C까지 냉각한 실험 6과 12에서도 글리세롤 또는 DMF로 처리한 고양이 뇌 조직의 미세균열 형태와 세포 손상 정도를 알아보기 위해 표본을 만들었다.

실험 3~5에서는 큰 균열이 없었지만 모든 조직학 표본에서 미세균열이 관찰되었다. 다만 그 형태는 −196°C까지 냉각한 무처리 양 뇌 조직(The Immortalist 1996년 제27권 제7/8호 31쪽)과 냉동보호제를 관류한 양 뇌 조직(The Immortalist 1997년 제28권 제3/4호 48~50쪽)의 미세균열과 달랐다. −90°C까지 냉각할 때 생긴 고양이 뇌 조직의 미세균열은 열기계적 응력 때문이 아닌 것으로 보인다. 그러한 손상은 −90°C보다 낮은 온도에서 나타나는 특징이 있기 때문이다. 일종의 얼음 결정 형성으로 생긴 것일 수 있다. 따라서 ‘−90°C 냉각에서 생긴 미세균열’은 ‘공동’ 또는 ‘얼음 구멍’이라고 부르는 편이 낫다.

세 번째 실험: 글리세롤 처리 머리를 −90°C까지 냉각

뇌 조직의 조직학 표본을 니슬 염색법(Nl)과 헤마톡실린·에오신 염색(h.-e.)으로 염색했다. 모든 현미경 사진의 배율은 헤마톡실린·에오신 염색에서 350배, 니슬 염색에서 700배였다. 공동 또는 얼음 구멍의 전형적인 모습은 백질의 현미경 사진 1·2와 회백질의 사진 2·3에 나타난다. 백질의 공동은 회백질보다 더 둥글었다. 얼음 구멍이 차지하는 비율은 회백질의 약 20%, 백질의 약 40%였다. 그림 5는 공동이 없는 회백질의 전형적인 모습이다. 그림 6·7은 별 모양의 신경세포를 보여 준다. 세포 모양은 불규칙했고 세포핵은 염색되어 있었으며 핵소체는 희미하게 보였다. 피라미드 신경세포도 비슷한 모습이었다(그림 8·9). 붕괴 중인 신경세포는 매우 드물게 관찰되었다(그림 9).

네 번째 실험: 무처리 머리를 −90°C까지 냉각

백질의 공동은 실험 3의 백질에 있는 공동보다 다소 컸다(그림 10). 회백질에도 공동이 있었다(그림 11·12). 얼음 구멍은 회백질의 약 30%, 백질의 약 50%를 차지했다. 신경세포의 상태는 실험 3보다 나빴다. 염색이 더 강하게 되었고 핵소체는 보이지 않았다(그림 13·14는 별 모양 신경세포, 그림 15·16은 피라미드 신경세포).

다섯 번째 실험: 무처리 두개골을 −90°C까지 냉각

뇌 조직의 공동 분포와 크기는 실험 4와 매우 비슷했다. 그림 17·18은 백질의 전형적인 공동, 그림 19·20은 회백질의 전형적인 공동을 보여 준다. 신경세포의 상태는 실험 4보다 조금 더 나빴다. 붕괴된 신경세포가 많이 발견되었다(그림 21·22는 별 모양 신경세포, 그림 23은 피라미드 신경세포).

여섯 번째 실험: 글리세롤 처리 머리를 −196°C까지 냉각

원문에 따르면 실험 6과 7의 뇌 조직에서 보이는 주요 조직학적 특징은 공동과 열기계적 응력으로 생긴 미세균열이 함께 있다는 점이다. 백질에는 실험 3의 백질에서 본 것과 유사한 공동만 있었다(그림 24·25). 얼음 구멍은 백질의 약 40%를 차지했다. 그림 26은 공동이 없는 백질 영역이다. 회백질에는 공동과 전형적인 미세균열이 나란히 있었다(그림 27·28). 미세균열은 대개 회백질과 백질의 경계에서 끝났다(그림 29). 얼음 구멍은 회백질의 약 20%, 미세균열은 약 10%를 차지했다. 따라서 이 뇌 내부의 미세균열은 비교적 적었다. 그림 30은 균열과 공동이 없는 회백질 영역이다. 신경세포 주변에는 액체가 다소 고여 있었다. 신경세포는 실험 3의 뇌 조직과 매우 비슷했다(그림 31·32는 별 모양 신경세포, 그림 33·34는 피라미드 신경세포).

열두 번째 실험: DMF를 관류한 뇌의 냉각·가온

DMF를 냉동보호제로 사용한 실험 10~12 가운데 상태가 가장 좋았으므로 이 실험을 조직학 평가 대상으로 택했다. 뇌 조직의 형태는 실험 6과 매우 비슷했다. 백질에 있는 공동의 모습과 개수도 유사했다(그림 35). 회백질에는 전형적인 미세균열이 있었다(그림 36·37). 다만 균열이 조금 더 자주 나타났고 크기도 다소 컸다(그림 38·39). 따라서 이 뇌에는 실험 6의 뇌보다 큰 균열이 더 많았다. 그러나 실험 6과 달리 신경세포체 주변에는 액체가 사실상 고이지 않았다(그림 40 및 36~39). 신경세포의 구조 역시 실험 6과 비슷했다.

결국 −90°C까지 냉각한 고양이 뇌 조직에는 큰 균열이나 큰 파열로 이어지지 않는 공동만 있었다. −196°C까지 냉각한 조직에는 공동뿐 아니라 일부가 큰 균열로 이어진 미세균열도 있었다. 글리세롤과 DMF는 낮은 농도에서도 신경세포의 보존 상태를 어느 정도 개선했지만, 신경세포는 여전히 상당히 나빠 보였다.

고양이 실험 3~5를 −90°C까지 냉각한 무처리 양 머리 실험(The Immortalist 1996년 제27권 제7/8호 31~32쪽)과 비교하면, 양 뇌 조직은 냉각 후 공동이 없었으므로 고양이 뇌 조직보다 저온에 잘 견디는 것처럼 보인다. 다만 양 뇌의 냉각 속도는 시간당 20°C, 즉 분당 0.33°C로 고양이 뇌보다 느렸다. 고양이 실험 중에서는 실험 4의 속도만 이에 가까웠다. 실험 4에서는 −6°C에서 −64°C까지 1.3°C/분, −64°C에서 −90°C까지 0.33°C/분이었다.

고양이 실험 6과 12를 양 뇌를 더 빠르게 냉각한 실험(약 10°C/분, The Immortalist 1997년 제28권 제3/4호 48~50쪽)과 비교하면, 양 뇌 조직에는 공동이나 얼음 구멍이 없었지만 많은 미세균열과 큰 균열로 인한 손상은 더 심했다. 양과 고양이 뇌 조직에서 미세균열이 자라는 속도가 달랐을 수 있다. 양 뇌에서는 미세균열이 신경세포를 가로질렀으므로 더 빠르게 자랐을 수 있다. 고양이 뇌에서는 절단된 신경세포가 매우 드물었으므로 미세균열과 공동이 더 느리게 자랐을 수 있다. 고양이의 신경세포는 천천히 자라는 미세균열이나 공동에 의해 옆으로 밀려났을 가능성이 있다. 냉각된 고양이 뇌 조직은 양 뇌 조직보다 더 유연하게 변형된 것으로 보인다.

−90°C에서 −196°C까지의 구간을 분당 1°C로 냉각·가온한 고양이 뇌

인간 뇌를 계산할 때와 마찬가지로(The Immortalist 1997년 제28권 제3/4호 50쪽), 루빈스키 방정식(Cryobiology 제17권 66~73쪽, 1980년)을 사용해 고양이 뇌에 균열이 생기지 않을 것으로 예상되는 냉각·가온 속도를 계산했다. (The Immortalist의 해당 글에서는 모든 반지름 R을 제곱해야 한다. 내가 보낼 때에는 그렇게 적었지만, 글을 위해 이메일 내용을 다시 편집하는 과정에서 R 위의 지수 2가 빠졌을 수 있다.)

고양이 뇌의 평균 무게는 21g, 뇌를 구형으로 보았을 때의 반지름은 1.71cm였다. 심한 균열이 생길 수 있는 속도의 기준은 27°C/분이었고, 균열이 생기지 않을 것으로 예상되는 속도의 기준은 2.7°C/분이었다. 루빈스키 방정식에 따르면 균열이 생기지 않아야 할 1°C/분을 선택했지만, 실제로는 균열이 발생했다.

실험과 사진의 번호는 보고서 1부에서 이어진다.

실험 13: 글리세롤 처리 고양이 두개골(46.6g)의 냉각

이 실험과 실험 14의 냉각·가온은 높은 원통형 진공 플라스크에서 수행했다(실험 2.2.1 참조). tc1의 냉각 속도는 0°C에서 −30°C까지 37.5°C/분, −30°C에서 −80°C까지 27.3°C/분이었다. −90°C에서 −196°C까지는 이후 모든 실험에서 1.5~1.0°C/분이었다. tc2는 −5°C에서 −80°C까지 12.8°C/분이었고, −90°C에서 −196°C까지는 이후 모든 실험에서 1.0°C/분이었다. 가온 속도는 tc1에서 −196°C에서 −80°C까지 이후 모든 실험에서 1.5~1.0°C/분, −80°C에서 0°C까지 11.3°C/분이었다. tc2에서는 −196°C에서 −80°C까지 이후 모든 실험에서 1.0°C/분, −80°C에서 −5°C까지 5.3°C/분이었다. 고양이 뇌의 무게는 18g이었다.

사진 11.1~11.3은 가온하고 고정한 두개골 속 뇌를 보여 준다. 윗면에는 큰 균열이 없었다(사진 11.1). 아랫면의 왼쪽 아래에는 큰 균열 하나가, 왼쪽 위에는 작은 균열 하나가 있었다(사진 11.2). 그러나 사진 11.3에서 보듯 균열은 표면에만 있고 뇌 내부로 이어지지 않았다. 사진의 왼쪽 위 절편은 뇌의 아래쪽 부분이다. 이 뇌의 내부에는 큰 균열이 없었다(사진 11.3).

실험 14: 실험 13의 반복

이 실험에서는 고양이 머리의 글리세롤 관류가 제대로 이루어지지 않았다. 두개골을 해동하고 뇌 조직의 글리세롤 농도를 측정한 후에야 이를 알게 되었다. 글리세롤 함량은 실험 13의 절반이었다. 두개골은 53.5g, 뇌는 20.2g이었다. tc1의 냉각 속도는 0°C에서 −30°C까지 34.3°C/분, −30°C에서 −80°C까지 25.2°C/분이었다. tc2는 −5°C에서 −80°C까지 10.3°C/분이었다. 가온 속도는 tc1에서 −80°C에서 0°C까지 27.8°C/분, tc2에서 −80°C에서 −5°C까지 10.0°C/분이었다.

사진 12.1~12.3은 고정된 뇌를 보여 준다. 뇌에서 혈액은 잘 씻겨 나갔다. 윗면에는 큰 균열이 없고 상태가 좋아 보였다(사진 12.1). 아랫면의 가운데 왼쪽에는 작은 균열 하나가 있었다(사진 12.2). 내부에서는 큰 균열 6~8개가 발견되었다(사진 12.3). 균열이 더 많았던 것은 글리세롤 농도가 낮았기 때문일 가능성이 크지만 다른 원인도 있을 수 있다. 두개골이 든 용기를 높은 원통형 진공 플라스크 안에서 위아래로 움직일 때 두개골이 플라스크 벽에 부딪혀 −90°C에서 −196°C 사이의 냉각·가온 중 큰 균열이 시작되었을 수도 있다. 이를 확인하기 위해 제어된 냉각·가온을 위한 새 챔버를 사용했다. 그 안에서는 머리나 두개골을 움직이지 않았다. 이어지는 고양이 실험 15~17은 이 냉각 챔버에서 수행했다.

(새 챔버는 1997년 3월에 만들었으나 그때에는 사용하지 않았다. 유사한 실험에서 기존 진공 플라스크는 액체질소 5~7L를 소비한 반면 새 챔버는 실험당 20~30L를 소비했기 때문이다. 당시에는 액체질소를 구하기 어려웠지만 새 챔버를 이용한 작업은 기존 챔버보다 쉬웠다. 새 챔버의 핵심 부분은 가온용 구리 코일이 달린 용량 600mL의 화학 실험용 유리 용기다. 이 챔버와 함께 찍은 내 사진을 보내 드렸다.)

실험 15: DMF를 관류한 고양이 머리(372g)의 냉각

tc1의 냉각 속도는 0°C에서 −30°C까지 36.2°C/분, −30°C에서 −80°C까지 25.2°C/분이었다. tc2는 −5°C에서 −80°C까지 7.1°C/분이었다. 가온 속도는 tc1에서 −80°C에서 −18°C까지 10.8°C/분, −18°C에서 0°C까지 7.5°C/분이었다. tc2는 −80°C에서 −5°C까지 3.4°C/분이었다. 머리에서 적출한 뇌의 무게는 23.0g이었다.

사진 13.1~13.3은 고정한 뇌를 보여 준다. 윗면과 아랫면에 큰 균열은 없었고 상태가 좋아 보였다(사진 13.1~13.2). 그러나 내부에는 균열 10~12개가 있었다. 주로 사진 13.3의 오른쪽 위 절편에 해당하는 뇌의 윗부분에 있었다. 균열의 크기는 실험 14의 내부 균열보다 작았다.

실험 16: 글리세롤 처리 고양이 머리(390g)의 냉각 — 실험 13의 반복

이 실험에서 글리세롤 관류는 정상적으로 이루어졌다. 원문에는 이 머리의 뇌 무게가 먼저 18g이라고 적혀 있다. tc1의 냉각 속도는 0°C에서 −196°C까지 1.5~1.0°C/분이었고, tc2는 −5°C에서 −196°C까지 1.0°C/분이었다. 가온 속도는 tc1에서 −196°C에서 0°C까지 1.5~1.0°C/분, tc2에서 −196°C에서 −5°C까지 1.0°C/분이었다. 원문은 이어서 뇌의 무게를 20.4g이라고 기록한다.

사진 14.1~14.3은 고정한 뇌를 보여 준다. 윗면과 아랫면에는 큰 균열이 없었다(사진 14.1~14.2). 그러나 내부에서는 큰 균열 8~10개가 발견되었다(사진 14.3). 그중 네 개는 실험 15의 DMF 처리 뇌 내부 균열보다 컸다. 실험 13의 글리세롤 처리 뇌와 비교하면 균열 수도 더 많았다. 하지만 글리세롤 농도가 낮았던 실험 14보다는 보존 상태가 좋았다.

실험 17: DMF를 관류한 고양이 머리(485g)의 냉각 — 실험 15의 반복

냉각·가온 속도는 실험 16과 같았으며 약 1°C/분이었다. 뇌의 무게는 23.0g이었다. 윗면과 아랫면에는 큰 균열이 없었다(사진 15.1~15.2). 하지만 내부에서는 균열 10~12개가 발견되었다(사진 15.3). 원문의 설명에 따르면 실험 13과 마찬가지로 균열은 주로 뇌의 윗부분, 사진 15.3의 오른쪽 위 절편에 있었다. 그중 일부는 앞서 언급한 실험 13의 뇌 내부 균열보다 컸다.

전반적으로 글리세롤을 사용한 실험 13과 DMF를 사용한 실험 15의 결과는 실험 16과 17에서도 잘 재현되었다. 따라서 두개골이 부딪히는 충격은 깊이 냉각된 고양이 뇌의 균열 정도에 영향을 주지 않았다. 충격이 있었던 실험 13의 결과가 충격이 없었던 실험 16보다 약간 더 좋기까지 했다. 실험 13~17의 모든 뇌에는 큰 균열이 있었으므로 조직학 표본은 만들지 않았다.

결론

1. 양 실험에서와 마찬가지로 이 고양이 실험에서도 DMF가 글리세롤보다 우수하다는 결과는 나오지 않았다.
2. 루빈스키 방정식은 개선이 필요하다.