글: 유리 피추긴 박사, 크라이오닉스 연구소 상근 저온생물학자

크라이오닉스 연구소(CI)에서 보낸 두 번째 연구 연도에 나는 쥐의 해마 절편을 이용한 실험 67건을 수행하며 200개의 과제를 진행했다. 또한 살아 있는 쥐의 심장을 이용한 실험 9건, 쥐 머리 전체의 관류 실험 18건, 양 머리의 관류 실험 8건을 수행할 수 있었다.

모든 실험의 목적은 CI를 위한 유리화 방법을 개발하는 것이었다. 연구 결과를 이용해 연구소가 특허를 출원할 가능성이 있으므로 실험의 구체적인 결과를 보고할 수는 없다. 나는 살아 있는 쥐의 뇌 절편과 기능적 칼륨/나트륨(K/Na) 비율 측정법을 이용해, 가장 우수한 동결보호제들을 여러 방식으로 조합한 유리화 혼합액을 시험했다. 몇몇 유리화 혼합액은 뇌 절편을 약 75%의 생존율로 저온보존할 수 있었다. 가장 우수한 혼합액을 사용했을 때는 살아 있는 뇌 절편을 −135°C까지 유리화한 후에도 85%의 생존율을 얻었다. 반면 CI의 글리세롤 방법은 가장 좋은 동결 조건에서도 뇌 절편 생존율이 20%에 그쳤다. 85%와 20%는 큰 차이다.

나는 가장 우수한 유리화 혼합액을 살아 있는 쥐의 심장에도 시험하려 했다. 심장의 회복은 ‘전부 아니면 전무’의 원칙을 따른다. 심장이 조화롭게 박동하거나, 일부 세동만 나타나다가 심장을 배양하는 동안 멈추게 된다. 안타깝게도 쥐의 심장은 가장 우수한 유리화 혼합액을 사용했을 때 깊은 냉각을 하지 않아도 회복하지 못했다. 현재 알려진 모든 동결보호제는 유리화가 가능한 높은 농도 (55~70%)에서는 살아 있는 장기에 독성을 나타내거나, 더 낮은 농도에서는 동결 손상으로부터 장기를 보호하지 못한다. 저온생물학은 아직 심장, 신장, 간 등의 살아 있는 장기를 이식할 수 있을 만큼 완전히 회복시키는 저온보존 방법을 개발하지 못했다.

오늘날 크라이오닉스는 현대 저온생물학과 달리 완벽한 저온보존 방법이 나올 때까지 기다릴 수 없다. 법적으로 사망한 환자에게는 이미 사망의 원인이 된 신체적 결함이 있으며, 그에 따른 모든 후유증도 미래의 의학 기술로 치료해야 하기 때문이다. 뇌 조직의 생존율 85%는 CI가 이전에 사용한 저온보존 방법과 비교하면 좋은 결과다. 따라서 환자의 뇌 전체와 신체 전체에 적용할 수 있는 더 나은 방법을 개발해야 한다. 이를 위해 유리화 방법은 뇌 절편뿐 아니라 살아 있는 동물의 뇌 전체에서도 시험해야 한다.

쥐 머리 전체를 대상으로 연구하기 시작했을 때 쥐의 혈액뇌장벽이라는 장애물에 부딪혔다. 쥐의 혈액뇌장벽은 사람이나 양, 토끼, 고양이, 개 같은 다른 포유류의 혈액뇌장벽보다 동결보호제를 훨씬 덜 통과시켰다. 최근 사망한 양의 머리에 동결보호제를 관류한 나의 최근 실험에서는, 양의 혈액뇌장벽이 글리세롤조차 쥐보다 더 잘 통과시킨다는 사실을 확인했다. 그러나 동결보호제가 더 잘 침투하는 동시에 뇌의 탈수도 상당한 수준으로 나타났다.

안타깝게도 크라이오닉스 연구소는 허가 없이 쥐 이외의 살아 있는 동물을 대상으로 연구할 수 없다. 허가를 받는 비용은 연구소에 너무 큰 부담이다. 죽은 양의 머리는 이 목적에 적합하지 않다. 살아 있는 해마 절편에 민감하게 반응하는 기능적 K/Na 비율 측정법을 사용하려면 살아 있는 토끼가 필요하다. 나는 토끼의 머리에 동결보호제를 관류하고, −130°C까지 냉각해 그 온도에서 보관한 다음, 다시 가온하고 동결보호제를 씻어낼 수 있다. 이후 세척한 토끼의 뇌에서 해마 절편을 만들어 K/Na 비율 측정법으로 생존율을 평가할 수 있다. 살아 있는 토끼를 합법적으로 연구할 수 있는 허가를 보유한 지역 대학에서 작은 연구실을 빌릴 수 있을지 알아볼 계획이다.

살아 있는 쥐의 뇌 절편을 대상으로 한 연구는 매우 유용했다. 그 결과는 앞으로 머리 전체에 동결보호제를 관류하는 실험에서도 여전히 의미가 있다. 포유류의 뇌세포는 종이 달라도 실질적으로 큰 차이가 없기 때문이다. 토끼의 뇌세포에 적용하는 실험적 유리화 조건을 쥐의 뇌 절편에 적용한 조건과 같게 만들 수 있다면, 두 경우의 세포 생존율도 실험 오차 범위 안에서 같을 수 있다. 혈액뇌장벽이 해당 물질을 충분히 통과시키는 경우, 예를 들어 독성 화합물이나 약물에 대해 시험관 내 뇌 절편의 세포 생존율과 생체 내 뇌 전체의 세포 생존율이 비슷하다는 점이 확인된 바 있다. 확산을 이용해 쥐의 뇌 절편을 탈수시킨 실험과, 쥐 머리에 글리세롤 또는 자당을 관류해 뇌 조직 전체를 탈수시킨 실험에서도 K/Na 비율 측정법에 따른 세포 생존율은 거의 같았다.

향후 연구에는 두 가지 계획이 있다. 첫 번째는 최상의 결과를 얻기 위한 이상적인 계획이다.

• 표준 조건의 0°C에서 사후 사람의 혈액뇌장벽을 통해 일어나는 탈수와 글리세롤 침투의 정도를 확인한다. 인체 기증 시신은 비교적 신선해야 한다. 구체적으로는 0°C에서 보관한 시간이 12~24시간을 넘지 않아야 한다.
• 혈액뇌장벽을 통한 글리세롤 침투 양상에서 어떤 동물이 사람과 가장 가까운지 확인한다. 토끼, 고양이, 작은 개를 사용해야 한다. 이는 후속 연구에 적절한 동물 모델을 선정하는 과정이다.
• 적절한 동물 모델과 K/Na 비율 측정법 및 전기생리학을 이용해, 성능이 좋은 여러 유리화 혼합액 중 최상의 혼합액을 선정한다.
• 비교적 신선한 사후 인체 기증 시신을 이용해 최상의 유리화 혼합액을 시험하고, 머리를 −130°C에서 유리화해 본다.
• 사람의 머리에 균열이 생기지 않게 −196°C까지 냉각할 수 있는지 연구한다.

이 계획을 미국에서 수행하는 것은 CI에 매우 어렵고 비용도 많이 들 것이다. 러시아의 크라이오닉스 연구자 및 과학자들과 협력한다면 러시아에서 수행할 수 있을지도 모른다고 생각한다.

두 번째 계획은 대학에서 필요한 허가를 갖춘 연구실을 빌릴 수 있다면 미시간 지역에서 살아 있는 토끼를 연구하는 것이다.

1. 뇌의 과도한 탈수는 심각한 손상 요인 중 하나이므로, 이를 피하면서 최상의 유리화 혼합액을 토끼 머리에 주입하는 최적의 방법을 찾는다. 이를 위해 동결보호제 관류의 최적 기술 조건, 즉 동결보호제 투여 속도, 온도와 온도를 낮추는 속도, 유리화 혼합액의 동결보호제 농도를 높이는 속도를 결정한다.
2. 최상의 유리화 혼합액으로 최적 수준까지 포화시킨 토끼 머리를 −130°C까지 냉각해 완전히 유리화되는지 확인한다.
3. 토끼 머리에서 동결보호제를 씻어내는 최적의 방법을 찾고, 세척한 뇌에서 뇌 절편을 만드는 절차를 이용해 결과를 평가한다.
4. 그 결과를 바탕으로 양과 사람의 머리에 적용할 유리화 방법의 기술적 조건을 계산한다.
5. 양 머리에 유리화 방법을 실제로 적용해 그 조건을 확인한다.