I. 자연계의 유리화

대부분의 생물은 몸의 상당 부분이 물로 이루어져 있지만, 이들을 얼린다고 해서 반드시 얼음이 형성되는 것은 아니다. 결빙을 견딜 수 있는 양서류와 곤충 사이에서도 견딜 수 있는 결빙의 정도는 크게 다르다.

일부 개구리는 “몸속 전체 수분의 최대 65%가 얼음인 상태”로 며칠 또는 몇 주를 보낼 수 있다. 어떤 양서류는 간에서 만들어지는 글리세롤 덕분에 보호를 받는다. 글리세롤은 일종의 ‘부동액’으로, 얼음 형성을 줄이고 어는점을 낮춘다. 글리세롤(글리세린)은 자동차 부동액에 쓰이는 에틸렌글리콜처럼 동결보호제다. 당인 포도당도 동결보호제이며, 북극 지방 개구리는 온도가 어는점에 가까워지면 포도당이 방출되고 세포 안으로 흡수되는 속도를 높이는 특수한 형태의 인슐린을 지니고 있다. 동결보호제는 결정이 형성되지 않은 채 물을 유리처럼 굳게 할 수 있는데, 이 과정을 유리화라고 한다. 세포의 동결 손상은 얼음 결정이 형성되면서 발생한다.

곤충은 동결보호제로 당류를 사용하는 경우가 가장 많다. 온도가 내려가면 먹이를 먹지 않기도 하는데, 낮은 온도에서는 대사가 느려지므로 큰 부담이 되지 않는다. 또한 단단한 왁스성 외피를 이용해 얼음의 핵을 만드는 물질이 몸 안으로 들어오는 것을 막는다. 북극 딱정벌레의 성충인 Pterostichus brevicornis는 보통 −35°C 이하를 견딘다. 실험실에서 이 딱정벌레를 −87°C로 5시간 동안 얼렸지만 뚜렷한 손상은 나타나지 않았다. 즉, “걷기, 먹이 섭취, 회피 반응과 같은 의도적이고 조화로운 활동을 보였으며 마비나 이상 행동은 없었다” [SCIENCE 166:106–107 (1969-10-01)]. 이 결과를 확인하거나 반박하려면 실험을 반복해 볼 가치가 있다. 이는 원칙적으로 신경 조직이 유리화에서 회복하여 기능할 수 있음을 시사한다. 그러나 이 생물들이 자연적으로 만들어 내는 글리세롤과 당류 등 동결보호제의 양만으로는, 현재의 저온생물학 지식으로 볼 때 그 놀라운 결빙 내성을 충분히 설명할 수 없다.

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II. 유리화의 물리화학

물은 점도가 높지 않으므로, 작은 시료를 초당 약 300만 °C의 극도로 빠른 속도로 −135°C까지 ‘순간 동결’해야 유리화할 수 있다. 이렇게 빠르게 냉각하면 물 분자가 결정 격자 구조로 배열될 시간이 없다. 물은 냉각되어도 점도가 거의 증가하지 않다가 어는점에서 갑자기 얼음 결정으로 상전이한다. 반면 녹은 실리카, 즉 이산화규소(SiO₂)인 액체 유리는 점도가 매우 높다. 실리카가 규칙적인 결정 격자로 배열되기보다 비정질 고분자 망상 구조를 형성하려는 성질 때문이다.

석영과 모래는 순수한 결정 형태의 SiO₂에 해당한다. 비결정 형태로 만든 SiO₂는 유리질 실리카, 즉 용융 실리카라고 한다. 산화물을 첨가하면 결정화를 막고 유리화를 촉진할 수 있다. 생산되는 유리의 약 90%를 차지하는 소다석회유리에는 SiO₂에 소다(Na₂O 또는 Na₂CO₃)와 석회(CaO)가 각각 약 12%씩 첨가된다. 소다는 결정화를 막는다는 점에서 동결보호제와 비슷하며, 석회는 유리가 물에 녹지 않도록 넣는다.

실리카를 매우 천천히 냉각하면 밀도가 높고 부피가 작은 수정 결정이 형성될 수 있다. 더 빨리 냉각하면 점성과 결정핵의 부재 때문에 결정화가 억제되어, 실리카는 어는점 아래로 과냉각된 다음 일정한 유리전이온도(T_g)에서 유리화한다. T_g 부근에서는 점도가 빠르게 증가하여 고체처럼 굳지만, 결정화나 용융과 달리 특정한 한 온도가 아니라 좁은 온도 범위에 걸쳐 일어난다. T_g에서 나타나는 변화는 상태 변화가 아니라 점도의 급격한 증가다. 위쪽 온도에서 T_g에 접근하면 점도가 매우 높아지므로, T_g는 ‘액체/유리 전이’보다 ‘고무/유리 전이’로 표현하는 편이 더 적절하다.

또한 T_g는 냉각 속도에 따라 달라진다. 냉각이 빠르면 T_g가 높아지고, 부피가 크고 밀도가 낮으며 더 비정질이고 점도가 낮은 고체가 만들어진다. 냉각이 느리면 T_g가 낮아지고, 부피가 작고 밀도가 높으며 비정질성이 약하고 점도가 높은 고체가 만들어진다. 실제로는 냉각 속도가 10배 달라져도 T_g는 3~5°C 정도만 변하므로 좁은 온도 범위에 머문다.

그러나 T_g 아래에서도 부피는 계속 줄고 점도는 계속 높아진다. 결정화와 달리 T_g에서의 변화는 질적 변화가 아니라 양적 변화다. 냉각은 바깥쪽에서 안쪽으로 진행되므로, 지나치게 빠른 냉각은 더 따뜻한 내부가 차가운 표면보다 더 수축해야 할 때 응력을 만든다. 천천히 냉각하면 균열이 줄어드는 이유다. T_g에서는 점도와 열용량이 갑자기, 흔히 몇 자릿수나 증가하지만 부피가 그만큼 갑자기 감소하지는 않는다. 실제로 T_g는 부피 감소의 속도가 느려지는 온도 범위로 특징지어지며, 그 아래에서도 부피는 선형적으로 계속 감소하고 점도는 증가한다. 점도의 급격한 증가는 응력뿐 아니라 열전도에도 영향을 줄 수 있으므로, T_g는 균열에서 중요한 온도일 수 있다. [T_g, 응력, 냉각 속도에 관한 추가 논의: 크라이오닉스 냉각의 물리적 매개변수, 「야금학과 세라믹에서 크라이오닉스가 얻는 교훈」.]

설탕도 실리카처럼 냉각 속도에 따라 결정인 사탕 결정이 될 수도, 유리 상태인 솜사탕이 될 수도 있다. 녹은 유리처럼 액체 설탕은 점도가 높고 비정질 고분자를 형성하기 쉽다. 실리카의 중합 결합은 공유결합과 이온결합이 혼합된 성격을 띠지만, 설탕에서는 반데르발스 힘이나 수소결합 같은 더 약한 힘이 중합을 돕는다. 두 경우 모두 이러한 결합에는 공유결합처럼 일정하게 정해진 결합 길이와 각도가 없다. 인체의 글리세롤·물 혼합물은 실리카보다 설탕에 더 가깝지만, 여러 염과 단백질, 지방 등이 있어 상황은 더 복잡하다.

유리화하는 액체는 ‘강한(strong)’ 물질과 ‘취약한(fragile)’ 물질로 분류된다. 여기서 ‘취약하다’는 말은 기계적 응력에 쉽게 깨진다는 뜻이 아니라, 위쪽 온도에서 T_g에 접근할 때 점도가 매우 급격하게 증가한다는 뜻이다. 취약하다고 불리는 물질에는 이온결합 또는 수소결합이 더 많고, 강한 물질은 공유결합이 더 많으며 T_g 위에서 점도의 변화가 비교적 완만하다. 이온결합에서는 T_g 부근의 결합력이 더욱 급격히 변한다. 공유결합은 더 강하며, 공유결합으로 묶인 분자 집단은 T_g 바로 위에서 분자 상태의 변화가 일어날 가능성이 더 낮다. 주로 수소결합으로 뭉치는 글리세롤 계열 동결보호제는 공유결합으로 결합한 유리질 실리카보다 ‘취약’하지만 이온성 물질보다는 덜 ‘취약’하다.

[취약성, 점도, 분자 이동성에 관해서는 「점도와 유리전이」 참고.] 빠른 냉각으로 유리화가 일어난다면, 빠르게 압력을 가해도 비슷한 결과를 얻을 수 있을 듯하다. 이때 온도는 빠른 냉각에서의 T_g보다 높을 수 있다. T_g가 냉각 속도의 함수라면 압력을 가하는 속도, 또는 그 속도와 냉각·동결보호제의 조합에 따라서도 달라지지 못할 이유는 없다. 압력이 얼음 I형 격자의 이상적인 사면체 배열을 뒤틀며, 이것이 결정핵 형성을 막는 데 중요할 수 있다는 사실도 알려져 있다.

물은 초당 수백만 °C의 속도로 냉각하면 유리화할 수 있다. 염이나 동결보호제와 혼합해도 유리화할 수 있다. 염 용액의 T_g는 공융 조성에서 가장 높지만, 그 농도는 저온생물학에 사용하기에는 지나치게 높다. 산화수가 높은 양이온(예: 3가 양이온)과 염기성이 강한 음이온(예: 구연산 이온)을 함유한 염 용액은 그렇지 않은 용액보다 유리를 더 잘 형성하며 T_g가 높다. 질산염은 염화물보다 잘 유리화하며, 마그네슘(Mg²⁺) 염은 아연(Zn²⁺) 염보다 잘 유리화한다 [THE JOURNAL OF CHEMICAL PHYSICS; Angell, CA; 52(1):1058–1068 (1970)].

실제로는 동결보호제 이외의 물질도 유리화를 도울 수 있다. 운반 용액은 유리화에 필요한 동결보호제의 양을 줄인다. CRYOBIOLOGY 27(5):492–510 (1990)에 설명된 운반 용액은 염, 덱스트로스, 글루타티온의 혼합물로, 토끼 신장 보관에 쓰이던 RPS-2 용액을 바탕으로 한다. 운반 용액이 물을 대체하는 정도는 2~5%에 불과하다. 그 효과는 주로 총괄성, 곧 분자가 원래 얼음을 형성할 수 있었던 물 분자 사이에 끼어드는 효과다. 좋은 운반 용액은 독성이 없고 필요한 동결보호제의 양을 줄여 그 독성도 낮춘다. [운반 용액에 관한 추가 설명: 크라이오닉스 프로토콜의 관류와 확산.]

아이스크림처럼 비결정성 용질의 수용액이 얼면, 얼지 않은 농축 용질 부분에서 T_g보다 열적 신호가 더 뚜렷한 전이온도 T_g′가 나타날 수 있다. T_g′는 얼음이 들어 있는 시료에서 얼지 않은 부분의 T_g다. 아이스크림의 T_g′는 약 −32°C이고 얼지 않은 물의 양(W_g′)은 중량 기준 약 35%다 [FOOD CHEMISTRY; Owen Fennema; 제3판; 표 11; 76쪽]. W_g는 T_g에서 시료의 수분 함량이고, W_g′는 T_g′에서 얼지 않은 물의 함량이다. 후자를 ‘결합수’라고도 하지만 모든 유리화 시료의 수분 함량에 그 용어를 적용할 수 있는 것처럼 들릴 수 있다. 분자량이 낮은 용질에서는 보통 분자량이 커질수록 T_g′와 T_g가 높아진다. 전분·글루텐·콜라겐·알부민 등 분자량이 큰 생체고분자의 T_g′는 대체로 −10°C 부근이다.

동결보호제 수용액도 얼 수 있으며, 이때 얼지 않은 부분은 T_g보다 상당히 높은 T_g′에서 굳는다 [JOURNAL OF FOOD SCIENCE; Brake, NC; 64(1):10–15 (1999)]. 시료에서 최대한 동결 농축된 부분의 유리전이온도(T_g′)는 정의상 T_g와 마찬가지로 매우 높은 점도를 보여야 한다 [FOOD RESEARCH INTERNATIONAL; Bai, Y; 34(2–3):89–95 (2001)]. T_g′는 공융 온도보다 낮다 [PURE & APPLIED CHEMISTRY; Goff, HD; 67(11):1801–1808 (1995)]. 단백질 용질에 염기성 아미노산과 하이드록시 다이카복실산의 혼합물을 넣으면 수소결합 망을 통해 T_g′를 높일 수 있다 [CHEMICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN; Izutsu, K; 57(1):43–48 (2009)]. 관류가 불완전한 크라이오닉스 환자처럼 원래 유리화하려던 혼합물에 얼음이 생기면, 얼지 않은 부분에 남는 유리화 혼합물의 농도가 높아져 T_g, 곧 T_g′가 더 높아진다 [그림 1; CRYOBIOLOGY; Wowk, B; 60(1):11–22 (2010)].

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III. 얼음 형성 억제제: 부동 단백질 포함

유리화를 돕는 또 다른 수단은 얼음 형성 억제제다. 동결보호제가 얼음 결정의 성장과 형성을 늦추는 데 비해, 얼음 형성 억제제는 결빙이 시작되기 위해 필요한 결정핵의 형성 자체를 겨냥한다. 북극의 물고기는 얼음 형성 억제 단백질을 이용해 몸의 어는점을 바닷물의 어는점인 −1.9°C보다 낮은 −2.2°C 이하로 유지한다. 일부 식물의 플라보놀 배당체는 어는점을 최대 9°C까지 낮출 수 있다 [CRYOBIOLOGY; Kasuga, J; 60(2):240–243 (2010)].

물의 녹는점은 0°C지만, 완전히 순수한 물은 −40°C보다 높은 온도에서 얼지 않는다. 결정 성장을 시작하려면 핵생성 물질이 필요하기 때문이다 [PHILOSOPHICAL TRANSACTIONS OF THE ROYAL SOCIETY OF LONDON; Lundheim, R; 357:937–943 (2002)]. 수돗물에는 핵생성 물질이 충분히 들어 있어 냉장고의 제빙 틀에서 0°C에 가까운 온도로 얼 수 있다. 핵생성 물질이 조금만 들어 있는 물은 과냉각될 수 있지만, 일단 얼음 결정이 생기면 폭발적인 속도로 퍼진다.

순수한 물이 어는 온도인 −40°C를 균질 핵생성 온도(T_h)라고 하며, 녹는점인 T_m(0°C)과 구별한다. T_h와 T_m 사이가 비균질 핵생성 영역으로, 얼음 형성은 시간과 핵생성 물질의 농도 또는 그 물질의 핵생성 능력에 좌우된다.

‘비균질’ 핵생성이라는 이름은 얼음 결정이 자라는 중심핵이 물 분자와 다른 종류의 분자로 함께 이루어진다는 데서 나왔다. 반대로 균질 핵생성에서는 결정핵에 물 분자만 들어 있다. 과포화된 설탕물의 온도가 내려갈 때 사탕 결정을 만드는 실은, 설탕 분자가 그 주위에서 결정화하도록 하는 비균질 핵 역할을 한다. 하늘에서 온도가 −40°C 부근인 극지방이나 고도 3만 피트 이상의 지역에서는 수증기가 충분히 농축되면 균질 핵생성이 일어난다. 요오드화은(AgI)은 물에 녹지 않고 결정 구조가 얼음과 충분히 비슷해 −5°C 이하에서 비균질 핵으로 쉽게 작용한다. 10나노미터보다 작은 입자로 분쇄할 수 있어 인공강우용 구름 씨앗으로 특히 적합하다.

균질 핵이 얼음 결정 성장을 시작할 수 있는 임계 크기는 −5°C에서 물 분자 45,000개, −20°C에서 650개, −40°C에서는 단 70개다 [Vali, G; 「Principles of Ice Nucleation」, BIOLOGICAL ICE NUCLEATION AND ITS APPLICATIONS, 5쪽; Lee 외 편, APS Press (1995)]. 진동 분광법에서는 기체 상태의 물 분자가 약 275개 모이면 얼음과 비슷한 구조가 나타나기 시작한다 [SCIENCE; Pradzynski, CC; 337:1529–1532 (2012)]. 임계 크기보다 작은 얼음 핵은 용해성 때문에 저절로 사라진다. 따라서 균질 핵생성 온도는 시료 부피와 시간의 함수다. 그러나 그 관계는 지수함수적이어서, −40°C보다 온도가 올라가면 핵생성이 매우 빠르게 줄어들며 몇 도 이상 높은 곳에서는 거의 관찰되지 않는다 [CRYOBIOLOGY 41(4):257–279 (2000)]. 순수한 물의 부피 V가 시간 Δt 동안 균질 핵생성으로 얼 확률은 J(T) × V × Δt이며, 온도 T에서의 핵생성률 J(T)는 실험적으로 도출된 다음 식으로 나타낸다.

J(T)의 단위는 m⁻³·s⁻¹, T의 단위는 °C다 [Vali, 앞의 책, 4쪽]. e^−3.9T 항은 온도가 1°C 떨어질 때마다 핵생성 확률이 약 50배, 4°C 떨어지면 50⁴배인 600만 배 이상 커짐을 뜻한다. 부피와 시간은 확률에 선형적으로 작용하지만, 온도의 지수함수적 효과 때문에 −38°C부터 −42°C 사이에서는 확률이 사실상 0에서 1로 급변한다. 실용적으로는 거의 −40°C다.

예상할 수 있듯 동물의 비균질 핵생성 확률은 몸집, 즉 부피가 클수록 높아진다. 체중이 20g 미만인 일부 파충류는 −5°C보다 낮은 온도까지 과냉각될 수 있지만, 40g이 넘는 파충류는 −2°C까지도 과냉각되지 못한다 [Costanzo, JP·Lee, RE Jr.; 「Supercooling and Ice Nucleation in Vertebrate Ectotherms」, BIOLOGICAL ICE NUCLEATION AND ITS APPLICATIONS, 229쪽 (1995)].

압력이 높아지면 T_h는 낮아지고 T_m은 높아진다 [CRYOBIOLOGY 21(4):407–426 (1984)]. 동결보호제의 농도를 높이면 T_h와 T_m이 모두 낮아지지만 T_h에 미치는 영향이 훨씬 크다. 그림의 양방향 화살표가 가리키듯 T_m을 30°C 낮출 만큼의 동결보호제는 T_h를 유리전이온도 T_g까지 내려 균질 핵생성을 없앤다. 얼음 형성 억제제로 비균질 핵생성까지 막으면 동결보호제 농도가 대략 55%일 때 모든 핵생성, 즉 얼음 형성을 없애고 유리화를 이룰 가능성이 생긴다.

그림의 양방향 화살표는 조직 동결보존에서 다뤄야 할 다른 현상에도 주의를 끈다. 핵생성은 아래쪽 화살촉 부근인 T_g 바로 위, 대략 −80~−120°C에서 가장 활발하고, 얼음 결정의 성장 속도는 위쪽 화살촉 부근인 T_m 바로 아래, 대략 −80~−40°C에서 가장 빠르다. 화살촉의 정확한 위치 자체가 중요한 것은 아니다. 중요한 점은 냉각해 유리화할 때가 다시 데워 탈유리화할 때보다 얼음 결정을 피하기 훨씬 쉽다는 것이다. 냉각 중 −80~−120°C에서 생긴 수많은 핵은 재가온 중 −80~−40°C에서 얼음을 대량으로 성장시킬 수 있다. 이를 탈유리화 문제라고 한다. 얼음 형성 억제제가 사용되기 전에는 고주파 재가온 기술만이 탈유리화 과정에서 얼음 생성을 피할 만큼 충분히 빠른 재가온을 이룰 수 있다고 생각했다. 얼음 형성 억제제는 재가온 중 얼음 결정의 성장을 크게 억제한다.

얼음 결정은 같은 평면에 놓인 여섯 개의 대칭적인 a축을 따라 자라거나, 그 평면에 수직인 c축을 따라 자랄 수 있다. 온도가 높을 때의 결정 성장은 대개 a축을 따라 일어나며, 눈송이의 익숙한 육각형 모양이 여기서 비롯된다. c축 성장은 손상을 일으킬 수 있는 바늘 모양의 침상 얼음 결정을 만든다 [THE FASEB JOURNAL; Davis, PC; 4(8):2460–2468 (1990)]. 얼음 형성 억제제는 ① 비균질 핵생성 물질에 결합해 불활성화하거나 ② a축 성장을 막거나 ③ c축 성장을 막는 방식으로 작용한다. 부동 단백질에서는 트레오닌·세린 등의 아미노산이 얼음과 수소결합한다 [CRYOBIOLOGY 41(4):257–279 (2000)]. 북극 물고기의 부동 단백질은 대개 a축 성장을 억제한다. 반면 북극 곤충의 부동 단백질은 보통 c축 성장을 억제한다. 물고기 단백질은 주상면(a축)에 결합해 어는점을 1°C 남짓 낮추지만, 곤충 단백질은 기저면(c축)에 결합해 4~5°C까지 낮출 수 있다 [BIOPHYSICAL JOURNAL; Pertaya, N; 95(1):333–341 (2008)].

모든 얼음 형성 억제제가 단백질인 것은 아니다. 21st Century Medicine(21CM)의 연구자들은 풀이나 우표 접착제 등에 흔히 들어 있는 폴리비닐알코올을 교대배열 입체화학형으로 사용하면 매우 효과적인 얼음 형성 억제제가 된다는 사실을 발견했다. 동일배열형에서는 수산기가 모두 분자의 같은 쪽에 있지만, 교대배열형에서는 분자의 양쪽에 번갈아 놓인다.

교대배열형 폴리비닐알코올은 크기와 형태가 얼음 결정 표면에 달라붙기에 매우 알맞다. 분자의 모든 수산기가 물 분자와 수소결합한다. 폴리비닐알코올 분자는 −30°C처럼 비교적 높은 온도에서도 얼음 결정에 달라붙어 성장을 막지만, 그보다 온도가 높아지면 분리가 시작되어 억제 효과가 줄어든다. 이 물질은 c축 성장을 막는 데 특히 효과적이며, 핵생성이 가장 활발한 온도 범위에서 효과가 가장 크다.

21st Century Medicine의 연구자들은 비닐아세테이트 20%와 비닐알코올 80%로 구성된 특허 공중합체를 만들어 Supercool X-1000이라는 상품으로 판매한다. 비닐아세테이트가 비닐알코올끼리 서로 뭉치는 현상을 줄여 얼음 형성을 억제할 수 있는 비닐알코올의 양을 늘리는 것으로 여겨진다 [CRYOBIOLOGY 40(3):228–236 (2000)]. X-1000을 0.01% 넣으면 유리화에 필요한 글리세롤의 양을 3%, 1% 넣으면 5% 줄일 수 있다. X-1000을 1%보다 더 많이 넣어도 추가 이득은 크지 않다.

수치상으로는 작은 차이처럼 보일 수 있지만, 얼음 형성 억제제의 이점은 실제로 매우 크다. 유리화에 필요한 높은 농도에 도달할수록 동결보호제의 독성은 지수함수적으로 증가한다. 크라이오닉스에서 특히 중요한 점은 동결보호제의 농도가 높아지면 점도가 지나치게 높아져 관류가 어려워지는 반면, 얼음 형성 억제제는 점도를 거의 높이지 않는다는 것이다. 따라서 두 물질을 함께 쓰면 관류와 유리화가 모두 가능한 용액을 만들 수 있다.

환경 전반에 생물학적 핵생성 물질이 널리 존재하기 때문에 물은 −40°C가 아니라 0°C 부근에서 언다. 가장 풍부하고 널리 분포하는 핵생성 물질은 식물, 특히 잎과 지상부에서 조기 동해를 일으키는 Pseudomonas syringae 세균의 표면 단백질이다 [PHILOSOPHICAL TRANSACTIONS OF THE ROYAL SOCIETY OF LONDON; Lundheim, R; 357:937–943 (2002); APPLIED MICROBIOLOGY; Maki, LR; 28(3):456–459 (1974)]. 이런 단백질은 10나노미터보다 큰 단단한 얼음 유사 구조를 이루고 서로 뭉칠 수 있어야 한다 [JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY; Kajava, A; 232(3):709–717 (1993)].

21st Century Medicine의 연구자들은 비균질 핵생성 물질에 특별히 결합해 이를 불활성화하는 얼음 형성 억제제도 찾아냈다. 해당 세균 단백질은 가능한 한 높은 온도에서 얼음을 만들도록 진화했다. 선형 고분자인 폴리글리세롤(PGL)은 이 단백질에 결합해 불활성화하며 폴리비닐알코올(PVA)의 작용을 보완한다. PGL은 부피가 작은 시료에서 핵생성을 억제하는 데는 효과가 낮지만, 큰 부피에서 처음 일어나는 얼음 핵생성 사건을 막는 데는 PVA보다 효과적이다. PGL 0.1%와 PVA 0.9%를 사용할 때 눈에 보이는 핵생성 사건이 가장 적다 [CRYOBIOLOGY 44(1):14–23 (2002)]. PVA 역시 비균질 핵생성 물질에 결합할 수 있다. 21CM은 이 조성을 Supercool Z-1000으로 판매한다.

얼음 형성 억제제는 세포막을 통과하지 못하고 손상되지 않은 혈액뇌장벽도 지나지 못한다. 따라서 상태가 좋은 크라이오닉스 환자라면 뇌에서 이 물질이 들어 있는 곳은 뇌의 약 4%를 차지하는 혈관계뿐이다. 세포 안에는 핵생성 물질이 거의 없으므로 얼음 형성 억제제가 필요하지 않다. 동결보호제가 세포 안으로 확산되면 충분하다. 뇌혈관 안의 억제제는 혈관에서 생성된 얼음 결정이 혈액뇌장벽을 넘어 퍼지는 일을 막을 수 있으며, 순환 장애로 관류가 약한 부위에서는 특히 유용할 수 있다. 그러나 크라이오닉스 환자에게는 순환 장애가 심한 경우가 많고 혈액뇌장벽도 자주 손상된다. 관류가 부족하면 동결보호제 농도가 낮아져 얼음 형성의 위험이 커지지만, 그런 부위에서는 얼음 형성 억제제의 농도도 낮아져 효과를 내지 못할 수 있다.

한 가지 주의할 점은, 유리화를 일으킬 만큼 동결보호제가 충분하지 않거나 냉각이 빠르지 않은 상태에서 얼음 형성 억제제만 사용하면 억제제를 쓰지 않았을 때 더 높은 온도에서 형성되었을 얼음보다 손상이 큰 얼음이 생길 수 있다는 것이다. 높은 온도에서 생성되는 얼음은 주로 세포 밖에 형성되어 세포의 물을 빼앗는다. 낮은 온도에서는 삼투 작용이 약하다. 따라서 억제제가 단지 얼음 형성 시점을 더 낮은 온도로 미루는 데 그친다면, 그때 생기는 얼음은 세포 안에 생길 가능성이 커지고 손상도 더 심해진다.

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IV. 세포·조직·장기의 동결보존

1949년 글리세롤로 황소 정자를 동결 손상에서 보호할 수 있다는 사실이 발견되었다. 1년 뒤 같은 기법이 적혈구에도 성공적으로 적용되었다. 그 이후 황소 정자와 인간 혈액의 동결보존을 중심으로 큰 산업이 형성되었다.

1959년에는 다이메틸설폭사이드(DMSO)가 동결보호제로 유용하다는 사실이 입증되었다. DMSO는 글리세롤보다 세포막을 더 쉽게 통과하지만 높은 온도에서는 독성이 더 강할 수 있다. 1972년에는 느린 냉각과 DMSO·글리세롤의 숙련된 조합을 통해 8세포기 생쥐 배아를 액체질소 온도까지 보존하고, 다시 데워 살아 있는 생쥐를 얻었다. 먼저 글리세롤을 넣고 배아를 낮은 온도로 냉각한 다음 투과성이 매우 높은 DMSO를 넣으면 독성 효과를 최소화할 수 있다.

1983년 Trounson과 Mohr는 8세포기 인간 배아를 사용해 처음으로 임신을 성립시켰다. 이 배아는 DMSO 농도를 단계적으로 높여 삼투 손상을 막을 충분한 평형 시간을 주면서 액체질소 온도까지 동결보존되었다. 순서는 PBI 10분, DMSO 0.25M 10분, 0.5M 10분, 1.0M 10분, 1.5M 10분이었다 [FERTILITY AND STERILITY 46(1):1–12 (1986)].

1983년 이후 인간 배아는 DMSO뿐 아니라 글리세롤과 프로필렌글리콜로도 동결보존되고 있다. 배아의 생존율은 발달 단계가 2세포기에서 4세포기일 때 가장 높다. 현재 전 세계에서 동결보존 중인 인간 배아가 정확히 몇 개인지는 아무도 모르지만 적어도 100만 개는 된다. 한때 액체질소 온도의 배아였던 살아 있는 아이도 수만 명에 이른다. [관련 기술의 온라인 검토: 「인간 난자와 배아의 동결보존」.]

선충(C. elegans) 유충의 50% 이상과 성충의 약 3%는 액체질소 온도까지 냉각한 후 살아남을 수 있다. 필요한 절차는 0°C에서 5% DMSO로 10분간 전처리한 뒤, 분당 0.2°C의 속도로 0°C에서 −100°C까지 냉각하고, 액체질소(−196°C)에 담갔다가 마지막으로 분당 27.6°C의 속도로 −10°C까지 데우는 것이다 [CRYOBIOLOGY 12(5):497–505 (1975)]. 이는 선충이 소화계와 생식기관, 근육, 약 300개 뉴런으로 이루어진 신경계를 갖춘 완전한 기능의 생물이라는 점에서 특히 주목할 만하다.

뇌처럼 수분과 지방 함량이 높은 장기에서는 매우 섬세한 세포 간 관계, 즉 시냅스 연결을 보호할 만큼 제대로 관류하기가 특히 어려울 것으로 예상된다. 그러나 뇌가 어느 정도 얼음 결정화를 견딜 수 있다는 사실은 1950년대부터 알려져 있다. Audrey Smith는 햄스터를 약 −1°C까지 천천히 냉각하여 뇌 수분의 60% 이상이 결정성 얼음으로 변한 뒤에도, 다시 데웠을 때 정상적인 행동에 눈에 띄는 큰 손실이 없음을 보여 주었다 [PROC. ROYAL SOCIETY B 145:427–442 (1956); BIOLOGICAL EFFECTS OF FREEZING AND SUPERCOOLING, A. U. Smith 편, 304–368쪽]. 세포 내 얼음 결정화와 세포 내 염 농도 상승이 가장 큰 손상을 일으킨다는 점이 이 결과를 설명한다. 조직을 천천히 냉각하면 세포 밖에서 먼저 결정화가 시작되고 세포 속 물이 밖으로 이동해 세포외 공간에서 언다. 세포 내 전해질 농도가 높아지더라도 60% 수준에서는 관찰 가능한 신경학적 손상을 일으킬 정도는 아닌 것으로 보인다.

[뇌 조직 동결보존에 관한 더 최근의 연구: 「해마 절편 동결보존 프로젝트」.]

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V. 글리세롤을 이용한 장기와 크라이오닉스 환자의 동결보존

동결보호제인 글리세롤은 오랫동안 인간 혈액과 정자를 유리화하는 데 사용되었고, 수년간 인간 크라이오닉스 환자의 결빙을 줄이는 데도 사용되었다. 그러나 글리세롤만으로는 장기나 환자를 완전히 유리화할 수 없다. 완전한 유리화에 필요한 만큼 높은 농도로 장기를 관류할 수 없기 때문이다. 최대 농도의 글리세롤로 관류하면 조직에 들어간 양으로 부분적인 유리화는 이루어지지만 약 20%의 얼음이 형성된다.

조직과 장기의 동결보존은 작은 세포 집단의 동결보존보다 훨씬 어렵다. 동결보호제가 장기 안으로 스며들고 온도가 내부까지 전달되는 데 시간이 걸린다. 혈액 순환이 없다면 온도가 매우 낮아도 조직은 손상될 수 있지만, 온도를 매우 낮추면 동결보호제의 관류 속도가 느려진다. 더구나 장기가 제대로 기능하려면 중요한 세포 간 관계가 유지되어야 하므로, 극히 적은 양의 얼음도 손상을 줄 수 있다. 그런데도 동결보호제를 이용해 골수, 태아 심장, 장, 부갑상샘, 피부, 비장, 흉선 등을 드라이아이스 온도인 −79°C까지 천천히 냉각하여 얼음 결정 손상 없이 보존한 사례가 있다.

글리세롤을 냉각한다고 반드시 결정화가 일어나는 것은 아니다. 글리세롤 68% v/v(부피/부피)와 물의 혼합물은 영하 어느 온도에서도 결정화하지 않고 유리처럼 굳는다. 하지만 55% v/v를 훨씬 넘는 글리세롤은 크라이오닉스에서 사용하기에 점도와 독성이 지나치게 높다고 여겨져 왔다. Alcor가 유리화 용액을 사용하기 직전, 저온생물학자 Brian Wowk는 58.4% v/v(8M) 글리세롤에 X-1000 얼음 형성 억제제 1%를 혼합하면 2리터 플라스크를 유리화할 수 있다고 판단했다. 이는 아마도 같은 혼합물로 뇌를 유리화할 수 있음을 뜻할 것이다.

대부분의 조직은 천천히 냉각할 때 수분의 80% 이상이 얼음 결정이 되어도 재가온 후 뚜렷한 손상을 보이지 않을 수 있다. 대부분의 장기는 수분의 40%가 얼음 결정이어도 재가온 후 손상을 견딜 수 있다. 앞서 말했듯 뇌는 특히 얼음 결정에 대한 내성이 강해 수분의 60%가 얼음 결정이 되어도 큰 손상은 적다.

I. Suda의 실험 [NATURE 212:268–270 (1966); BRAIN RESEARCH 70:527–531 (1974)]에서는 고양이의 뇌를 15% v/v 글리세롤 속에서 −20°C로 냉각해 뇌 수분의 62%가 얼음이 된 상태로 각각 777일과 7.25년 동안 보관했다. 두 뇌 모두 재가온 후 정상처럼 보이는 뇌파 패턴을 보였지만, 7.25년 보관한 뇌는 신경 활동이 더 적었다. 관류액에 영양분인 포도당을 첨가하고, 해동·재관류 과정에서 뇌의 글리세롤을 신중히 씻어내고, 더 높은 글리세롤 농도로 더 낮은 온도에서 보관했다면 이 시료의 출혈과 세포 손실을 막을 수 있었을 것이다.

유리화 용액을 설명한 논문 [CRYOBIOLOGY 24:196–213 (1987)]에 따르면, 영하의 어느 온도에서든 얼음에 의한 기계적 손상을 막는 데 필요한 글리세롤의 부피 백분율 C는 다음과 같다.

P는 결정 손상 없이 얼음으로 바뀔 수 있는 장기 액체 부피의 백분율이다. 이 식은 그 논문의 그림 3에 나오는 직선의 방정식이며, 글리세롤 68%와 물 32%의 부피 혼합물이 완전히 유리화한다는 사실과 관련된다.

뇌의 최소 60%가 신경학적 손상 없이 얼 수 있다는 결과를 대입하면 다음과 같다.

즉 글리세롤 27.2% v/v(3.72M)면 액체질소 온도 −196°C를 포함한 모든 영하 온도로 뇌를 냉각할 때 얼음 결정 손상을 막기에 충분하다는 뜻이다. 실제로 실온에서 글리세롤 23% v/v(3M)로 관류하고 드라이아이스 온도 −79°C까지 냉각한 토끼 뇌는 광학현미경에서 우수한 조직학적 보존 상태를 보였다 [CRYOBIOLOGY 21(4):407–426 (1984)]. 크라이오닉스 연구자들은 수년간 최소 3.72M 글리세롤이라는 ‘스미스 기준’이 환자의 동결 손상을 막는 데 충분할 수 있다고 믿었다.

[참고: 글리세롤은 1,2,3-프로판트라이올이며 분자량은 92.09g/mol, 20°C에서 밀도는 1.2613g/cm³이다. 글리세롤의 몰농도를 부피 백분율로 바꾸려면 7.30을 곱한다.]

1991년 12월호 CRYONICS 잡지에서 한 저온생물학자는 토끼 뇌 하나를 실온에서 3.72M 글리세롤로 관류해 −130°C까지 냉각한 뒤 얇은 조각으로 잘라, 그 조각을 −78°C에서 여러 달 보관하고 전자현미경으로 조사한 결과를 설명했다. 그는 얼음 형성의 양상이 상당한 손상을 일으킬 가능성이 있어 보이며, 살펴보는 곳마다 두꺼운 얼음층이 뇌 조직을 가로지른다고 썼다.

그렇다면 뇌 수분의 60%가 얼음이었던 Audrey Smith의 햄스터가 신경 기능을 완전히 회복한 것은 어떻게 설명할 수 있을까? 이 질문을 받은 저온생물학자는 답하지 못했다. 그는 또 당시까지 측정한 생화학적 기능은 열악한 조건에서도 얼렸다 녹인 뒤 모두 살아남았으며, 이는 전자현미경 결과와 맞지 않을 가능성이 있다고 썼다. 따라서 전자현미경 결과가 실제 손상을 보여 주는지, 아니면 관찰 과정에서 생긴 인공산물인지 의문이 제기되어 왔다고 했다. 이어 해동 후 조직의 배열이 대체로 다시 자리 잡는 모습은 틈이 있는 곳까지 포함해 거의 기적처럼 보이지만, 광학현미경의 해상도 아래에 있으면서 전자현미경에는 잘 보이는 광범위한 손상이 있을 가능성은 높다고 설명했다.

한 실험자가 준비한 토끼 뇌 시료 하나의 결과를 받아들일 때는 신중해야 하지만, 그 관찰이 Audrey Smith의 결과와 완전히 모순되는 것은 아니다. 예상대로 관찰된 결빙은 세포 안이 아닌 세포 밖에서 일어났다. 다만 관찰된 손상은 Smith의 햄스터가 완전히 신경학적으로 회복했다는 결과뿐 아니라, 동결보호제 없이 −70°C까지 냉각한 온전한 뇌 조직의 시냅스 중 80%가 신선한 뇌 생검 시료 시냅스의 대사 특성을 유지했다는 결과와도 맞지 않아 보인다 [「Metabolically Active Synaptosomes can be Prepared from Frozen Rat and Human Brain」, JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY 40:608–614 (1983)]. 글리세롤 동결보호제가 어떤 방식으로든 세포외 손상에 기여하는 것은 아닐까? 어쨌든 크라이오닉스에서는 글리세롤 농도를 3.72M(27.2% v/v) 이상으로 올리기 어렵지 않다. 연구자들은 동결보호제 독성으로 생존력이 떨어지는 것보다 구조적 손상을 없애는 일을 더 중시하는 편이다. 글리세롤은 높은 농도에서 세포 안으로 잘 관류되지 않고 삼투 작용으로 세포의 물을 끌어내 탈수를 일으킨다.

전자현미경에서 관찰된 세포 내 손상의 증거 이후 Alcor와 뒤이어 CryoCare는 가능한 한 높은 글리세롤 농도로 환자를 관류하기 시작했다. 그 결과 환자는 체적이 줄어들 정도로 심하게 탈수되었다. 글리세롤의 높은 점도 때문에 도달 가능한 최대 농도는 55% v/v(7.5M)였으며, 유리화에 필요한 68% v/v에는 한참 못 미쳤다. 얼음 형성 억제제와 결합하면 8M 글리세롤에서 유리화가 가능하다는 추정도 있지만, 사람의 몸에 실제로 그 농도까지 글리세롤을 넣을 수 있어야 한다. 현재 크라이오닉스 환자에게는 보통 글리세롤 대신 유리화 가능한 동결보호제가 관류된다.

환자에게 한 장소에서 글리세롤을 관류한 뒤 다른 보관 장소까지 드라이아이스(고체 이산화탄소)와 함께 운송하는 경우가 있었다. 글리세롤의 고화 온도 T_g는 −90°C로 드라이아이스 온도인 −79°C보다 낮다. 하지만 드라이아이스 온도에서는 글리세롤의 점도가 충분히 높기 때문에 글리세롤을 투여한 환자를 며칠 동안 드라이아이스에 두어도 큰 손상은 생기지 않는다. 반대로 드라이아이스가 녹아 환자의 온도가 다시 올라가면 손상이 매우 클 수 있다.

글리세롤을 투여한 환자에서 액체 부분은 대략 물 20%와 글리세롤 80%로 이루어진다. 앞의 얼음 형성 억제제 장에 나오는 그림처럼 동결보호제 농도가 높아질수록 녹는점 T_m은 빠르게 낮아진다. 글리세롤을 투여한 환자에서는 −60°C 이상에서 상당한 얼음이 녹는다. 녹으면서 결빙으로 생긴 조직 파편이 풀려나고, 미래의 분자 복구 기술에 쓰일 수 있는 구조 정보가 손실된다. 또한 재가온 때의 동결보호제 독성은 냉각 중 같은 온도를 통과할 때보다 조직 파편과 손상 조직에 훨씬 심한 구조적 손상을 일으킬 수 있다. 따라서 글리세롤을 투여한 환자가 드라이아이스 온도에서 다시 데워지지 않도록 각별히 주의해야 한다.

[환자의 동결보호제 관류에 관한 추가 정보: 크라이오닉스 프로토콜의 관류와 확산.]

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VI. 당류를 이용한 동결보존

세포막, 곧 원형질막은 대부분의 동결 손상이 일어나는 곳이다. 따라서 좋은 동결보호제는 얼음 형성을 막는 부동 기능뿐 아니라 세포막도 보호할 수 있다. 반면 동결보호제의 독성은 모든 세포소기관이나 거대분자에 영향을 줄 수 있으며, 단백질이 가장 취약하다.

당류는 여러 수산기를 지닌 알데하이드 또는 케톤이다. 탄소 사슬 끝에 알데하이드기나 케톤기가 있고 옆에 수산기가 붙어 있다. 글리세르알데하이드는 매우 단순한 당이다. 많은 극지 식물과 곤충, 곰팡이에서는 독성이 낮은 동결보호제로 다량의 당과 당알코올(폴리올)이 발견된다. 과당은 결정화하지 않기 때문에, 과당이 더 저렴한데도 설탕으로 자당을 사용한다.

북쪽 지방의 개구리는 포도당을 동결보호제로 쓴다. 온도가 내려가면 간에서 많은 포도당을 만들고, 특수한 형태의 인슐린 덕분에 그 포도당이 세포 안으로 대량 유입된다. 심장과 뇌는 얼지 않지만 몸의 나머지 부분은 상당히 얼어, 개구리 몸의 3분의 2가 얼음이 된다. 해동되면 대사 손상을 막기 위해 포도당을 빠르게 제거해야 한다. 그러나 그만한 열량을 잃을 수 없으므로 포도당을 특별한 방광에 저장한다. 이곳의 포도당은 서서히 혈장으로 돌아와 대사에 쓰이거나 간에 저장된다 [JOURNAL OF MOLECULAR ENDOCRINOLOGY; Conlon, JM; 21(2):153–159 (1998)].

저온·결빙·탈수로부터 단백질과 세포막을 가장 잘 보호하는 두 이당류는 자당(과당+포도당)과 트레할로스(포도당+포도당)다. 자당은 결빙에 견디는 식물에서 가장 흔한 당으로, 식물은 추위에 대응해 자당의 양을 10배까지 늘릴 수 있다. 자당과 트레할로스는 냉각 중 세포막끼리 뒤섞이는 현상을 억제한다. 두 당은 인지질의 머리 부분에 결합하며 세포막에 잘 들어맞는다. 완전한 탈수를 견디는 생물은 건조 중량의 20%가 트레할로스다. 트레할로스의 수화 반경은 다른 당의 두 배를 훨씬 넘을 만큼 비정상적으로 크며, 다른 당과 달리 단백질을 둘러싼 수화층에서는 완전히 배제된다.

결빙 손상에 대한 보호와 유리화를 위한 보호는 서로 다를 수 있다. 전해질의 독성을 줄이는 일이 전자에는 더 중요하지만 후자에는 그리 중요하지 않을 수 있다. 자당과 에틸렌글리콜을 함께 사용해 인간 난자를 유리화한 사례가 있다 [HUMAN REPRODUCTION; Kuleshova, L; 14(12):3077–3079 (1999)]. 하지만 당류는 유리화보다 결빙과 냉각 손상을 막는 동결보호제로 더 자주 쓰인다. 이때 이당류인 자당은 단당류인 포도당보다 효과적이다 [CRYOBIOLOGY; Santarius, KA; 20(1):90–99 (1983); Carpenter, JF; 25(3):244–255 (1988)].

알데하이드(RCOH)와 케톤(RCOR′)에 존재하는 카보닐기(>C=O)는 특정 중금속 이온에 전자를 주어 양전하를 줄이는 환원 작용을 할 수 있다. 예컨대 +2가 구리 이온(Cu²⁺)은 케톤이나 알데하이드가 있으면 +1가 구리 이온(Cu⁺)으로 환원된다. 당은 케톤 또는 알데하이드이며 포도당은 알데하이드, 과당은 케톤의 예다. 환원된 구리와 철 이온은 펜톤 반응을 통해 손상을 일으키는 하이드록실 라디칼 생성을 촉진할 수 있다.

대부분의 당에는 자유로운 알데하이드기나 케톤기 말단이 있어 단백질의 라이신 또는 아르기닌에 있는 자유 아민기에 쉽게 결합한다. 이 과정을 당화라고 한다. 이런 반응에 참여하는 당을 환원당이라고 부른다. 고리 구조일 때 카보닐기가 보이지 않더라도 헤미아세탈 고리가 열리면 카보닐기가 노출되므로 모든 단당류는 환원당이다. 포도당이 아노머 형태 사이에서 전환될 때가 한 예다. 단당류는 이당류보다 동결보호제 용액에 더 잘 녹고 더 낮은 농도에서 유리화할 수 있지만 [CRYOBIOLOGY; Kuleshova, LL; 38(2):119–130 (1999)], 당화를 일으킬 수 있으므로 단백질과 접촉하는 시간은 짧게, 온도는 낮게 해야 한다. 220mM D-갈락토스 용액은 인간 배아 간세포의 동결보호에서 5% DMSO와 거의 같은 효능을 보였고 D-포도당보다 상당히 우수했지만 [GLYCOBIOLOGY; Chaytor, JL; 22(1):123–133 (2012)], 갈락토스의 당화 능력은 포도당보다 다섯 배 강할 수 있다.

맥아당 같은 일부 이당류는 두 단당류를 잇는 글리코시드 결합이 각 단당류의 헤미아세탈 고리가 열리는 것을 막지 못하므로 환원당이다. 반면 트레할로스와 자당은 그 결합이 고리가 열리는 것을 막아 비환원당이다. 다만 산성 조건에서는 자당이 트레할로스보다 환원당인 단당류로 훨씬 쉽게 가수분해된다 [CRYOBIOLOGY; Crowe, JH; 43(2):89–105 (2001)]. 결빙 또는 저온 손상과 관련된 효소·세포막 안정성에 당화가 영향을 준다는 점에서 트레할로스는 자당보다 우수한 동결보호제다.

그러나 트레할로스와 자당 같은 이당류는 세포막을 통과하지 못하므로 이를 직접 합성하는 생물의 세포 내부 막만 안쪽에서 보호할 수 있다. 트레할로스는 효모가 탈수를 견디게 해 주며, 건조 중량의 최대 35%에 이를 수 있다. 바닷가재에서는 혈당으로 쓰이지만 척추동물은 트레할로스를 합성하지 않는다. 이 물질을 척추동물 세포 안에 넣어 세포 밖뿐 아니라 안에서도 동결보호 및 단백질·막 보호 효과를 얻기 위한 여러 방법이 시도되었다. 아프리카 깔따구 유충의 트레할로스 운반체 유전자 TRET1을 담은 플라스미드를 중국햄스터 난소세포에 도입하자 세포 속 트레할로스가 일곱 배로 늘고 건조 후 성장률이 400% 증가했다 [PNAS; Kikawada, T; 104(28):11585–11590 (2007); CRYOBIOLOGY; Chakraborty, N; 64(2):91–96 (2012)]. 미세주입으로 인간 난자에 트레할로스를 넣으면 동결보존 성적이 개선되었다 [FERTILITY AND STERILITY 77(1):152–158 (2002)]. 생쥐 난자에 0.5M 트레할로스를 주입하고 0.5M DMSO와 결합하자 동결 후 생존과 건강한 자손 출생에서 우수한 결과가 나왔다. 트레할로스만으로는 미토콘드리아나 소포체 같은 세포소기관 안에 들어가지 못하기 때문인 것으로 보인다 [BIOLOGY OF REPRODUCTION; Eroglu, A; 80(1):70–78 (2009)]. 트레할로스·DMSO 혼합물로 동결보존한 조직공학적 표피의 이식편은 신선한 대조군과 구별되지 않았다 [BIOMATERIALS; Chen, F; 32(33):8426–8435 (2011)]. 트레할로스는 자유라디칼을 제거해 거대분자를 보호할 수도 있다 [JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY; Benaroudj, N; 276(26):24261–24267 (2001)].

비투과성 동결보호제도 유리화를 도울 수 있다. 대부분의 핵생성 물질은 세포 밖에 있고, 탈수된 세포에서는 결합수 덕분에 세포 안이 유리화할 수 있기 때문이다. 당류가 참여하는 세포외 유리화는 세포막끼리 맞닿아 융합하는 일을 막는다 [ANNUAL REVIEW OF PHYSIOLOGY; Crowe, JH; 60:73–103 (1998)]. 세포막은 흔히 결빙 손상에 가장 취약한 세포 구조로 여겨진다.

트레할로스는 결합수를 밀어내고, 단백질과 인지질의 극성 말단에 결합수보다 강하게 수소결합하여 세포막을 보호한다 [ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS 245(1):134–143 (1986)]. 세포막 인지질 이중층에서는 트레할로스가 카보닐기에 결합한 물 분자를 밀어낼 수 있지만 자당은 그러지 못한다 [BIOPHYSICAL JOURNAL; Amalfa, F; 78(5):2452–2458 (2000)]. 자당은 분자 내부에서도 수소결합을 만들기 때문에, 적어도 부분적으로는 그 영향으로 트레할로스가 자당보다 물과 더 강하게 상호작용한다 [THE JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY B; Lerbret, A; 109(21):11046–11057 (2005)]. 트레할로스의 수화 반경은 자당보다 2.5배 크며, 같은 수준의 단백질 보호 효과를 내려면 자당의 농도를 2.5배 높여야 한다 [ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS; Sola-Penna, M; 360(1):10–14 (1998)]. 1.5M 트레할로스와 자당 용액의 수분 함량은 각각 부피 기준 62.5%와 87%다. 트레할로스의 큰 수화 부피는 얼 수 있는 물을 줄이고 점도를 높인다 [PROTEIN SCIENCE; Jain, NK; 18(1):24–36 (2009)]. 트레할로스가 얼음 결정 성장을 억제하는 효과는 자당의 약 두 배인데, 수화 반경이 더 크기 때문인 것으로 보인다 [JOURNAL OF CRYSTAL GROWTH; Sei, T; 240(1–2):218–229 (2002)]. 트레할로스 농도 41.7wt%에서 결정 성장 속도는 20.8wt%일 때의 약 4분의 1이며, 52.1wt%에서는 결정이 커질수록 성장 속도가 감소한다.

트레할로스의 유리전이온도 T_g는 자당과 연구된 다른 모든 이당류보다 높다. 이당류 전체의 평균 T_g는 단당류보다 약 60°C 높다 [FRONTIERS IN BIOSCIENCE; Furuki, T; 14:3523–3535 (2009)]. 수분 함량이 5%일 때 트레할로스의 T_g는 약 40°C, 자당은 약 15°C다. 44°C에서 45일 보관한 포도당·자당 시료는 비정질 상태를 완전히 잃었지만, 포도당·트레할로스 시료에서는 결정화된 부분이 4% 미만이었다 [BIOCHEMICA ET BIOPHYSICA ACTA; Sun, WQ; 1425(1):235–244 (1998)].

이당류는 세포막을 통과하지 않는 비투과성 동결보호제의 예다. 비투과성 물질이 효과를 내는 이유 중 하나는 핵생성 물질이 세포 안보다 밖에 훨씬 많아 얼음도 밖에서 더 쉽게 형성되기 때문이다. 일반적으로 비투과성 동결보호제의 독성은 투과성 동결보호제보다 훨씬 낮다. 효과적인 동결보호제 혼합물에는 두 종류를 함께 넣어 필요한 투과성 동결보호제의 양을 줄이는 경우가 많다. 비투과성 물질은 일부 작용으로 세포의 탈수를 유도하여 세포 안에 형성될 수 있는 얼음의 양을 줄인다. 그래서 결빙을 수반하는 전통적인 동결보존법에도 사용된다.

적혈구의 동결보존에는 투과성 동결보호제인 글리세롤이 널리 쓰이지만, 비투과성인 하이드록시에틸전분(HES)을 쓰려는 노력도 있었다. HES는 무해한 혈장 증량제여서, 글리세롤과 달리 재가온 후 수혈하기 전에 적혈구에서 제거할 필요가 없기 때문이다. 세척하지 않고 동결보존한 적혈구에서 늘어난 헤모글로빈, 곧 용혈이 해롭지 않다는 연구도 있었지만 [ANESTHESIA & ANALGESIA; Horn, E; 85(4):739–745 (1997)], 헤모글로빈 증가에 따른 신장 독성 우려 때문에 HES의 임상 사용은 이루어지지 않았다 [TRANSFUSION MEDICINE REVIEWS; Scott, KL; 19(2):127–142 (2005)]. 트레할로스와 덱스트란-40으로 액체질소에 보존한 적혈구는 정상적인 모양과 효소 활성을 유지했지만 ATP는 56% 감소했다 [CRYOBIOLOGY; Pellerin-Mendes, C; 35(2):173–186 (1997)].

[냉각·탈수 손상에서 당류의 역할: 「크라이오닉스에서의 생존력, 동결보호제 독성, 저온 손상」.]

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VII. 글리세롤 이외의 동결보호제를 이용한 유리화

글리세롤은 적혈구와 정자의 동결보존을 위해 저온생물학에서 널리 사용된 최초의 동결보호제(CPA)다. 얼마 지나지 않아 다이메틸설폭사이드(DMSO)의 가치도 발견되었다. 이후 자동차 부동액인 에틸렌글리콜과 과거 아이스크림의 얼음 형성을 줄이는 데 쓰이던 프로필렌글리콜 등 다른 폴리올도 효과적인 동결보호제임이 입증되었다. 글리세롤은 거의 모든 종의 정자 동결보존에 여전히 더 우수한 것으로 평가되지만, 토끼 정자에서는 락트아미드가 글리세롤을 썼을 때의 거의 두 배에 이르는 운동성을 보였다 [JOURNAL OF REPRODUCTION AND DEVELOPMENT; Kashiwazaki, N; 52(4):511–516 (2006)].

동결보호제는 유리전이온도(T_g), 투과성, 점도, 독성, 유리화에 필요한 농도(C_v) 등의 지표로 평가한다. C_v는 특정 동결보호제가 유리화하는 데 필요한 최소 농도다. 그보다 훨씬 높은 농도에서는 효과가 늘지 않고 독성만 증가하므로 기억해 둘 중요한 값이다.

아마이드는 폴리올보다 약한 동결보호제다. 포름아마이드만으로는 유리화할 수 없지만 다른 동결보호제의 유리화를 도울 수 있다. 아마이드와 폴리올 모두 메틸기가 추가되면 더 강한 동결보호제, 즉 C_v가 낮은 동결보호제가 된다. 이는 메틸화한 아마이드와 폴리올의 구조 및 C_v에서 확인할 수 있다 [CRYOBIOLOGY; Fahy, GM; 24(3):196–213 (1987)]. 핵자기공명(NMR) 연구는 메틸화가 극성기의 수소결합 강도를 높인다는 점을 시사한다 [JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY; Forsyth, M; 94:6889–6893 (1990)]. 프로필렌글리콜(1,2-프로판다이올)과 비교하면 1,3-프로판다이올은 유리화에 필요한 농도가 57%로 더 높고(프로필렌글리콜은 44%), 20%w/w 용액의 균질 핵생성 온도도 −60°C로 더 높다(프로필렌글리콜은 −68°C). 이는 1,3-프로판다이올이 더 약하며, 프로필렌글리콜과 비교했을 때 에틸렌글리콜보다도 독성이 약함을 보여 준다 [CRYOBIOLOGY; MacFarlane, DR; 27:345–358 (1990)]. 1,3-프로판다이올은 프로필렌글리콜보다 이당류분해효소를 훨씬 적게 억제한다 [BIOCHEMICAL MEDICINE AND METABOLIC BIOLOGY; 45(2):161–170 (1991)].

폴리올이 좋은 동결보호제라는 사실은 오래전부터 알려졌지만, 이제는 메톡시화합물처럼 독성이 더 낮고 더 잘 침투하는 다른 동결보호제도 검토되고 있다. 메톡시화합물이란 알코올에 메틸기(−CH₃)를 붙여 에터를 만든 물질이다. 그러나 삼투 효과를 제외하면, 글리세롤은 DMSO, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 메톡시화합물보다 세포막 손상이 가장 적은 동결보호제일 가능성이 높다. 다른 물질들은 세포막을 녹이는 성질이 더 강할 수 있기 때문이다. 다만 글리세롤은 생화학적 독성이 있어 신장 조직을 3~4M보다 높은 농도에 노출하면 생존력을 잃는다.

메톡시화합물의 독성은 에틸렌글리콜과 비슷할 수 있다. 예를 들어 사람 정자의 세포막은 글리세롤보다 에틸렌글리콜을 네 배 더 잘 통과시키며, 에틸렌글리콜의 막 수송은 글리세롤보다 온도의 영향을 덜 받는다 [HUMAN REPRODUCTION; Gilmore, JA; 12(1):112–118 (1997)]. 에틸렌글리콜은 38°C에서 간의 알코올탈수소효소에 의해 옥살산으로 대사되기 때문에 독성을 나타낸다. 옥살산은 뇌·심장·신장·폐·췌장에서 옥살산칼슘 결정으로 침전해 저칼슘혈증을 일으키며 신장에서 손상이 가장 크다 [Harrison, PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE]. 메톡시화합물은 쉽게 가수분해되므로 에틸렌글리콜처럼 에스터화되지 않은 글리콜, 곧 수산기가 두 개인 알코올과 독성이 비슷할 수 있다. 글리콜에터는 용혈이나 염색체 손상 같은 다른 독성도 나타낼 수 있다 [Casarett & Doull, TOXICOLOGY]. 다만 크라이오닉스 절차에서는 혈액을 씻어 내 간에서 생긴 대사물이 다른 세포에 도달하는 것을 막으므로, 이런 독성 효과 중 상당수는 나타나지 않을 가능성이 높다. 에틸렌글리콜의 독성도 대상마다 달라, 소의 배아에서는 독성이 없는 것으로 나타났다 [HUMAN REPRODUCTION; Gilmore, JA; 12(1):112–118 (1997)].

원형질막이 냉각 및 동결 손상의 가장 중요한 표적 구조인 것으로 보이므로, 세포막을 안정화하는 능력은 동결보호 작용의 중요한 측면이다. 프롤린, 베타인, 사르코신, 글리세롤, DMSO, 트레할로스, 자당은 모두 세포막 융합을 줄인다. 프롤린·베타인·사르코신은 소수성 상호작용을 통해 인지질 이중층을 안정화한다. 막과의 소수성 상호작용은 다른 동결보호제의 수소결합보다 막을 안정화하는 데 효과가 낮다 [CRYOBIOLOGY; Anchordoguy, TJ; 24(4):324–331 (1987)].

주요 동결보호제는 유리 형성 능력, 독성, 점도에 따라 배열할 수 있다. 45% v/v 용액의 유리 형성 능력이 높은 순서는 다음과 같다 [CRYOBIOLOGY; Baudot, A; 40(2):151–158 (2000)].

21st Century Medicine 연구자들이 신장 절편을 대상으로 수행한 연구에서는 상대적 독성의 순서가 유리 형성 능력의 순서와 일치하는 것으로 나타났다. 포름아마이드는 예외로, 유리 형성 능력은 가장 약하지만 독성은 가장 강하다. 여러 동결보호제를 혼합하면 각각의 독성이 낮아지는 경우가 많다. 점도가 높은 순서는 다음과 같다.

유리 형성 능력은 높고 독성과 점도는 낮은 동결보호제 혼합물을 찾는 것이 유리화 연구의 어려운 목표다.

2005년 저온생물학회 학술회의에서 21st Century Medicine은 토끼 신장을 고체 상태로 유리화했다가 재가온한 뒤 토끼에게 이식하여 완전한 생존력을 확인했다고 발표했다 [ORGANOGENESIS; Fahy, GM; 5(3):167–175 (2009)]. 같은 동결보호제 혼합물로 토끼 뇌도 얼음 형성 없이 유리화했다 [ANNALS OF THE NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES; 1019:559 (2004)]. 두 경우 모두 사용한 혼합물은 M22였다 [CRYOBIOLOGY 48:157–178 (2004)]. M22는 65% w/v(9.35M) 동결보호제 혼합물로 녹는점은 −55°C, T_g는 −123.3°C다. 생물학적 시료에 영하 22°C(Minus 22°C)에서 투입한다는 뜻으로 M22라는 이름을 붙였다. 유리화한 신장은 −135°C에서 4분 동안 보관했다.

M22에 든 물질은 PVP K12와, 엄밀히 동결보호제는 아닌 얼음 형성 억제제를 제외하면 대부분 세포막을 통과하는 투과성 동결보호제다. 사용된 보호제와 억제제는 다음과 같다.

• 다이메틸설폭사이드 22%
• 포름아마이드 13%
• 에틸렌글리콜 17%
• N-메틸포름아마이드 3%
• 3-메톡시-1,2-프로판다이올 4%
• PVP K12 3%
• Z-1000 얼음 형성 억제제 2%
• X-1000 얼음 형성 억제제 1%

동결보호제는 단순히 물에 넣는 것이 아니라, 흔히 장기 보존 용액으로도 기능하는 등장성 운반 용액에 넣는다. M22에 사용된 운반 용액은 LM5이며 포도당, 만니톨, 유당, KCl, K₂HPO₂, GSH, NaHCO₃, 아데닌 HCl의 혼합물이다 [표 1; CRYOBIOLOGY; Fahy, GM; 48(2):157–178 (2004)]. 얼음 형성 억제제를 추가하고 이전 운반 용액의 포도당을 줄이자 탈유리화를 막는 데 필요한 재가온 속도가 절반 이하로 낮아졌다. 운반 용액의 선택은 조직 회복에 영향을 줄 수 있으며 조직액의 조성도 영향을 미친다 [CRYOBIOLOGY; Wusterman, MC; 56(1):62–71 (2008)]. M22는 신장 절편에 맞춰 최적화되었다.

크라이오닉스 연구소의 동결보호제 용액인 CI-VM-1에는 에틸렌글리콜 35%와 DMSO 35%가 들어 있다. 함께 사용하면 독성이 낮아질 수 있는 한 쌍이다 [REPRODUCTION, FERTILITY, AND DEVELOPMENT; Gautam, SK; 20(4):490–496 (2008)]. 운반 용액인 m-RPS-2에는 포도당, KCl, HCl, TRIS 완충제가 들어 있다. CI-VM-1은 M22보다 유리화 능력이 강하고 가격도 훨씬 낮지만 독성은 더 높다. 저온생물학자 Yuri Pichugin 박사가 해마 절편을 대상으로 최적화했다.

[관련 자료: 「동결보호제의 독성」, 「크라이오닉스의 유리화 물질: M22」, 「새로운 동결보존 기술」.]

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VIII. 탈유리화 문제

탈유리화 문제가 생기는 이유는 결정핵이 가장 활발하게 형성되는 온도 범위가 얼음 결정의 성장 속도가 가장 빠른 온도 범위보다 훨씬 낮기 때문이다. M22에서 핵생성이 가장 활발한 온도는 −110~−120°C이고 −90°C와 −140°C에서는 거의 검출되지 않는다. 반면 결정 성장이 가장 빠른 온도는 −50~−60°C이며 낮은 쪽으로는 −95°C에서 검출되지 않는다 [CRYOBIOLOGY; Wowk, B; 55:330 (2007), 초록]. 동결보호제를 사용해 냉각할 때는 자랄 결정핵이 없으므로 결정의 최대 성장 온도 범위는 큰 문제가 아니다. 냉각에서 중요한 것은 T_g 가까이에서 증가하는 핵생성이다. 가장 좋은 방법은 핵이 형성되기 전에 T_g에 도달할 만큼 빨리 냉각하는 것이다. 핵이 생기더라도 빠른 냉각과 T_g 부근의 높은 점도 때문에 크게 자라지 못하므로 손상이 제한된다.

큰 얼음 결정이 가장 큰 손상을 일으키고 작은 결정은 손상이 적으며, 충분히 작으면 냉각 중 손상이 없을 수도 있다. 재가온할 때의 상황은 다르다. T_g에서 조금 올라가면 먼저 최대 핵생성 온도 범위를 지나고, 더 올라가면 최대 성장 속도 범위에 이른다. 냉각이나 재가온 중 생긴 작은 얼음 결정은 재가온 중 더 큰 결정이 자라기 위한 이상적인 핵이 된다. 유리화 용액의 재가온 중 또는 지나치게 느린 냉각 중에 얼음 결정이 자라는 현상을 탈유리화라고 한다. 유리 상태를 충분히 오랫동안 높은 온도에 두면 어느 온도에서든 탈유리화할 수 있지만, 재가온 때 결정 성장이 냉각 때보다 훨씬 심한 것을 특히 ‘탈유리화 문제’라고 한다. 오래된 아이스크림이 덜 맛있는 것도 큰 얼음 결정이 형성되기 때문일 수 있다.

한 가지 해결책은 매우 빠른 속도로 재가온하는 것이다. 전자레인지의 주파수인 2,450MHz는 적합하지 않다. 일부 조직은 과열되어 열변성이 일어나는 동안 다른 부분은 아직 차갑고 얼음 성장에 취약할 수 있기 때문이다. 그러나 300~1,000MHz 전자기파는 전자레인지 주파수보다 더 균일하게 가열할 수 있다. 전자기 가열의 균일성은 동결보호제의 유전 특성에 영향을 받는다. 적절한 주파수에서 변화하는 전기장은 유리질 고체의 극성 분자를 회전시켜 열전도에 영향을 미치는 격자파를 일으킬 수 있다. 저온에서는 드바이 모형이 온도에 따른 예상 열용량을 가장 정확하게 설명한다. 어떤 부분이 다른 곳보다 빨리 데워지고 그 과정에서 열전도율과 열확산율이 떨어지면 열폭주가 발생할 수 있다. 프로필렌글리콜은 434MHz 유전장에서 2,3-부탄다이올보다 균일하게 가열할 수 있다 [PHYSICS IN MEDICINE AND BIOLOGY; Robinson, MP; 47(13):2311–2325 (2002)].

Peter Mazur는 이미 근육과 신경을 비롯한 조직·장기로 분화한 약 5만 세포 초파리 배아를 에틸렌글리콜로 유리화하는 획기적인 실험에서, 탈유리화를 막기 위해 분당 100,000°C의 재가온 속도가 필수적임을 확인했다. 재가온 속도가 분당 2,000°C로 떨어지자 생존율은 12%에서 0%가 되었다 [SCIENCE; Mazur, P; 258:1932–1935 (1992)].

탈유리화를 막는 두 번째 방법은 폴리비닐알코올처럼 핵생성을 억제하는 물질을 사용하는 것이다. 세 번째는 얼음이 전혀 생길 수 없을 만큼 농도가 높은 동결보호제 혼합물을 사용하는 것이다. 21st Century Medicine이 2004년에 만든 동결보호제·얼음 형성 억제제 조성은 10mL 부피에서 분당 0.4°C라는 느린 재가온 속도로도 탈유리화를 피할 수 있다 [CRYOBIOLOGY 48:157–178 (2004)].

액체 상태에서 탈유리화를 완전히 막을 만큼 농도가 높지 않은 유리화 혼합물은 준안정 상태다. 충분히 빨리 냉각해 고체로 만들거나 충분히 빨리 데우지 않으면 탈유리화한다는 뜻이다. 임계 냉각 속도, 곧 탈유리화를 막는 데 필요한 최소 냉각 속도보다 느리게 냉각해 탈유리화하는 시료에서는 물이 얼음이 되어 혼합물에서 분리된다. 그러면 얼지 않은 부분에는 농도가 더 높은 유리화 혼합물이 남아 T_g는 높아지고 임계 냉각 속도는 낮아진다. 이렇게 높아진 T_g를 T_g′라고 한다. 크라이오닉스 환자의 관류가 불량하면 조직 속 유리화 용액의 농도가 낮아져 임계 냉각 속도가 올라가고 탈유리화할 가능성이 커진다. 탈유리화가 일어나면 어떤 부분에는 얼음이 생기고, 다른 부분에는 얼지 않은 고농도 부분이 생긴다. 후자는 Alcor의 M22 또는 크라이오닉스 연구소의 CI-VM-1에서 예상하는 통상적인 T_g −123°C 대신, −110°C만큼 높은 T_g′에서 유리화할 수 있다. 이런 경우 균열을 줄이려면 T_g가 아닌 T_g′보다 높은 온도에서 느린 냉각을 시작해야 한다. [균열에 관해서는 다음 장, T_g′의 추가 설명은 「유리의 몇 가지 성질」 참고.]

탈유리화 문제는 생존력을 최대한 지키려는 목표 때문에 생긴다. 동결보호제는 종류에 따라 차이가 있지만 모두 독성이 있다. 적은 양의 동결보호제를 사용하되 핵생성을 피할 만큼 빠르게 냉각하면 유리화할 수 있다. 그러나 독성을 고려할 필요가 없다면 가장 독성이 강한 동결보호제라도 충분히 높은 농도로 사용하여 어느 냉각 속도에서도 탈유리화가 일어나지 않게 할 수 있다.

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IX. 유리화 물질의 균열

T_g 부근에서는 표면 균열을 막기 위해 냉각 속도를 늦추는 것이 바람직하다. 저온에서 점도가 높으므로 결정화 위험을 크게 늘리지 않고도 그렇게 할 수 있다. 큰 생물학적 시료를 유리화할 때의 물리적 문제는 CRYOBIOLOGY 27(5):492–510 (1990)에 설명되어 있다. 그 논문에서 다루는 동결보호제는 글리세롤보다 T_g가 10~20°C 높은 프로필렌글리콜이다. 균열이 일어나는 온도가 T_g보다 많이 낮을수록 균열은 더 광범위하게 생기고 조각도 더 잘게 나뉜다.

큰 유리화 생물학적 물체를 빨리 냉각하면 바깥쪽이 안쪽보다 더 많이 수축한다. 엄밀히 말하면 바깥 표면에서 중심까지 온도와 수축 정도가 연속적으로 달라진다. 금속은 열응력이 쌓이지 않을 만큼 천천히 냉각할 수 있으며, 그렇게 하면 갈라지지 않고 원하는 온도까지 내릴 수 있다. 그러나 금속은 유리화 생물학적 물질을 묶는 수소결합보다 훨씬 강한 공유결합으로 결합되어 있다. 또한 금속은 열전도성이 훨씬 좋아 내부의 온도 차이가 훨씬 빨리 사라진다. 그럼에도 동결보호제가 스며든 시료의 T_g 이상 온도에서 측정된 열변형은 순수 동결보호제 시료의 약 4분의 3 수준에 불과했다 [ANNALS OF BIOMEDICAL ENGINEERING; Rabin, Y; 33(9):1213–1228 (2005)].

이론적으로는 크라이오닉스 환자를 열응력이 쌓이지 않고 균열도 생기지 않을 만큼 느리게 액체질소 온도까지 냉각할 수 있다. 실제로는 몇 주 또는 몇 달이 걸릴 수 있다. 사람의 머리만 한 물체도 T_g보다 20°C 이상 낮추면서 큰 균열을 피하기는 어렵다. 따라서 현실적으로는 균열을 최소화하도록 며칠에 걸쳐 냉각한다.

중간온도 보관(ITS)은 T_g 바로 아래인 −130°C에 보관하면 균열이 크게 줄어든다는 생각에 기반한다. 토끼 경동맥의 일부를 대상으로 냉각·재가온 속도를 최적화하고 −131°C 또는 −132°C 가까이에서 보관하며 저온 매크로스코프로 균열을 조사한 결과, 생존력을 유지한 채 유리화와 재가온에 성공했다 [CELL PRESERVATION TECHNOLOGY; Baicu, S; 4(4):236–244 (2006)].

하지만 −130°C 보관은 더 많은 공간과 그 공간을 냉각할 액체질소가 필요해 −196°C의 액체질소 온도에 보관하는 것보다 비용이 약 두 배 든다. ITS도 균열을 완전히 없애지는 못한다. 크라이오닉스 환자에게 관류가 불완전하면 일부에 얼음이 생기고 T_g′가 높아진 부위가 국소적으로 나타나기 때문이다.

ITS에서 사용하는 −135~−145°C 범위는 열응력에 의한 균열을 줄일 수 있지만, 수십 년이나 수백 년 동안 보관할 환자를 분자 수준의 분해로부터 지키기에는 충분히 낮은 온도가 아닐 수 있다. [「점도와 유리전이」 참고.] ITS는 액체질소 온도 보관보다 방사선 손상에도 더 취약할 수 있다. [「극저온에서의 방사선 손상」 참고.]

[크라이오닉스의 냉각 속도에 관한 추가 정보: 크라이오닉스 냉각의 물리적 매개변수.]

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