I. 도입부

냉각과 관련된 문제는 크라이오닉스를 성공적으로 시행하는 데 제약을 줍니다. 이러한 문제를 폭넓게 살펴보기 위해, 저는 점도·열팽창률·비열용량·열전도율·압축률·유리전이온도처럼 온도에 따라 변하는 성질에 관해 재료과학, 식품과학, 저온생물학에서 무엇을 배울 수 있는지 살펴보았습니다. 특히 유리화용 동결보호제가 이미 주입되었거나 주입 중인 크라이오닉스 환자의 냉각에 초점을 맞추지만, 먼저 저온생물학의 전통적인 냉각 방법부터 설명하겠습니다.

[사망 판정 직후의 초기 냉각에 관한 자세한 내용은 「지역 크라이오닉스 단체를 위한 긴급 대응 준비」를 참고하세요.]

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II. 저온생물학의 전통적인 냉각 방법

크라이오닉스와 저온생물학은 서로 다른 분야입니다. 크라이오닉스는 질병·노화·동결보존 과정 자체로 손상된 사람과 동물을, 미래 과학이 그 손상을 복구할 수 있으리라는 기대 아래 극저온에 보존하는 것입니다. 저온생물학은 저온이 생물에 미치는 영향을 연구하고 그 지식을 동결보존에 적용하려는 현재의 확립된 과학입니다. 크라이오닉스 연구자들은 저온생물학자들에게서 배워 이익을 얻습니다.

장기 보존은 유리화를 이용할 때 성공 가능성이 가장 높으며, 크라이오닉스 연구자들이 이 보존 방법에 큰 관심을 갖는 이유도 여기에 있습니다. 그러나 많은 저온생물학자는 여전히 결빙을 수반하는 전통적인 동결보존법을 사용합니다. 이 방법은 동결보호제의 독성을 최소화하면서 조직이나 장기가 아닌 세포 또는 배아에 적용할 경우 어느 정도 성공할 수 있기 때문입니다. 전통적인 동결보존법의 일부 원리는 유리화에도 관련되므로 크라이오닉스 연구자들이 이해할 가치가 있습니다.

살아 있는 세포 안의 물은 대략 삼투 작용에 참여하는 물과 단백질·DNA·인지질, 주로 단백질에 단단히 결합한 물로 나눌 수 있습니다. 이온도 물에 둘러싸여 수화됩니다. 그래서 원자번호가 19인 칼륨 이온은 수화된 지름이 3.8옹스트롬으로, 원자번호가 11인 나트륨 이온의 수화 지름 5옹스트롬보다 작아 더 좁은 이온 통로를 통과할 수 있습니다. 세포를 고장성 환경에 노출해 삼투적으로 탈수시키면, 삼투 작용으로 제거되지 않는 물은 세포 수분 전체의 약 10%입니다. 세포 수분의 10%가 거대분자와 수소결합으로 묶인 결합수라는 사실은 핵자기공명(NMR), 유전 측정, 흡착 등온선 및 열량측정으로 확인되었습니다. 열량측정에 따르면 결합수에는 융해열이 나타나지 않습니다. 즉, 세포 안에서 삼투 작용에 참여하지 않는 물은 얼지 않습니다. 결합수는 점도가 매우 높아 극저온에서 유리화합니다. 냉각 중인 세포를 시차주사열량계(DSC)로 측정한 결과도 세포 수분의 약 10%는 얼 수 없음을 보여줍니다 [CRYOBIOLOGY; Schrenders, PD; 33(5):487–501 (1996); Sun, WQ; 38(4):372–385 (1999)].

저온생물학자들은 세포에서 얼 수 있고 삼투 작용에 참여하는 물의 비율, 그리고 세포 부피에서 삼투 작용에 참여하지 않는 부분의 비율을 정량적으로 알아내려 합니다. 세포에서 삼투 비활성 부분은 세포의 고형 성분과 결합수로 이루어집니다. 이를 추정할 때 흔히 보일–반트호프 도표를 사용합니다. 이 도표는 세포 부피를 종속변수로, 외액의 오스몰랄농도 역수를 독립변수로 나타냅니다. 오스몰랄농도는 용액에 있는 삼투 활성 입자의 수, 즉 용액 1kg에 포함된 모든 용질의 몰수를 나타냅니다. 외액의 오스몰랄농도가 높을수록 더 많은 물이 삼투 작용으로 세포에서 빠져나와 세포 부피가 작아집니다. 세포를 오스몰랄농도가 서로 다른 여러 용액에 노출한 뒤 각 세포 부피를 측정할 수 있습니다.

오스몰랄농도가 지나치게 낮지 않다면 세포 부피와 외액 오스몰랄농도의 관계는 선형이므로, 측정값을 보일–반트호프 도표에 표시하면 거의 직선 위에 놓여야 합니다. 이 직선을 세로축까지 연장해 만나는 지점이 삼투 비활성 세포 부피입니다. 이는 외액의 오스몰랄농도가 무한대이고 세포가 삼투적으로 제거 가능한 물을 모두 잃어 수축한 상태에 해당합니다. 그림의 예에서는 세포 부피의 30%가 삼투 비활성입니다. 결합수 10%와 세포 고형 성분 20%로 이루어집니다. 사람 난모세포를 보일–반트호프 도표로 연구했을 때는 세포 수분의 거의 20%가 삼투 비활성인 것으로 나타났습니다 [JOURNAL OF REPRODUCTION AND FERTILITY; Newton, H; 117(1):27–33 (1999)].

세포는 삼투 활성 수분의 손실을 견딜 수 있지만, 결합수를 제거하면 생존력에 심각한 손상이 생깁니다. 결합수가 없으면 단백질은 구조를 잃고 세포막끼리 융합합니다 [CRYOBIOLOGY; Sun, WQ; 38(4):372–385 (1999)]. 다만 삼투성 수분을 잃어 세포 부피가 임계 수준 이하로 감소하면 전해질 손상만으로 설명할 수 없는 손상이 발생한다는 증거도 있습니다 [CRYOBIOLOGY; Williams, AJ; 17(6):530–539 (1980)].

저온생물학의 전통적인 동결보존법은 유리화하지 않고 세포나 배아처럼 작은 세포 집단을, 생존력 손실을 최소화하는 속도로 얼리는 데 초점을 맞춥니다. 그림은 대략 분당 1°C에서는 줄기세포, 분당 25°C에서는 정자, 분당 5,000°C에서는 적혈구의 약 60%가 생존할 수 있음을 보여줍니다. 세포 밖에는 핵생성 물질이 더 많고 강력하므로 세포 안보다 높은 온도에서 얼음이 훨씬 쉽게 생깁니다. 인체의 등장성 식염 농도는 염화나트륨(NaCl) 약 0.9%인 반면, NaCl 용액의 공융 결빙 농도는 중량비 22%입니다. 조직의 세포외 공간에서 순수한 물이 얼음이 되면 남은 식염수의 농도가 계속 올라가고, 중량비 22%에 이르렀을 때 공융 혼합물도 얼게 됩니다. 얼지 않은 부분에서 세포외 염 농도가 상승하면 삼투 작용으로 더 많은 물이 세포를 떠납니다. 세포에서 삼투 활성 수분이 모두 빠져나간 뒤에는 남은 결합수와 단백질이 세포를 유리화할 수 있습니다.

냉각 속도가 너무 빠르거나 느리면 세포 생존율이 대체로 0에 가까워져 역 U자형 곡선을 만듭니다. 너무 빠른 냉각은 빠져나오는 물 분자의 압력과 마찰이 막에 가하는 삼투 손상으로 세포를 죽일 수 있습니다. 또는 세포 밖 얼음보다 훨씬 해로운 세포 안 얼음이 생기게 할 수 있습니다. 지나친 삼투압이 원형질막에 구멍을 만들어 얼음이 세포 안에서 형성되게 한다는 증거가 있습니다 [BIOPHYSICAL JOURNAL; Muldrew, K; 66(2 Pt 1):532–541 (1994)]. 하지만 냉각이 극도로 빠르면 물이 세포를 떠날 시간이 없고 세포 내부가 유리화할 수도 있어, 두 효과 모두 생존율을 높일 수 있습니다 [CRYOBIOLOGY; Dumont, F; 46(1):33–42 (2003)]. 반면 지나치게 천천히 냉각하면 세포 밖에 만들어진 독성 수준의 고농도 전해질에 오래 노출되거나 세포외 얼음에 기계적으로 짓눌려 세포가 죽습니다. 패런트의 2단계 방법은 영하의 비교적 높은 온도까지 빨리 냉각한 다음 삼투 평형이 이루어질 때까지 그 온도에 머물고 다시 빠르게 냉각합니다.

최적의 냉각 속도는 세포막의 물 투과성과 그 투과성이 온도에 따라 달라지는 정도, 즉 활성화에너지에 따라 결정됩니다 [HUMAN REPRODUCTION; Devireddy, R; 15(5):1125–1135 (2000)]. 적혈구의 최적 생존 냉각 속도가 매우 빠른 것은 물을 세포막 너머로 빠르게 통과시키는 수분 통로 단백질인 아쿠아포린이 많기 때문입니다 [JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY; Yang, B; 276(1):624–628 (2001)]. 대부분의 세포와 마찬가지로 줄기세포에는 아쿠아포린이 없어 물이 인지질 이중층을 직접 확산해 지나가야 합니다.

저온생물학자들은 동결보호제를 유리화보다 결빙을 이용한 동결보존의 성적을 높이는 데 사용하는 경우가 일반적입니다. 동결보호제 독성에 노출되는 정도를 최소화하면서 얼음 형성을 줄이되 완전히 없애려 하지는 않습니다. 그림처럼 사람 적혈구에 글리세롤을 첨가하면 세포 생존 곡선이 더 낮은 온도 쪽으로 이동합니다. 분당 1.7°C의 느린 냉각과 빠른 해동 조건에서 글리세롤 농도가 1.95M 이상이면 모든 세포가 죽는 구간도 없어집니다. 용액에 얼음이 존재하기만 해도 얼음 표면에 흡착된 단백질이 변성될 수 있지만, 소량의 동결보호제로 이를 막을 수 있습니다 [BIOPHYSICAL JOURNAL; Strambini, GB; 70(2):971–976 (1996)].

유리화에는 부족한 농도의 동결보호제라도 천천히 냉각하는 세포는 보호하지만, 지나치게 빠르게 냉각하는 세포는 보호하지 못합니다. 물이 세포에서 확산해 나올 시간이 부족하거나, 빠른 삼투 확산 자체가 세포막을 손상시키기 때문입니다. 동결보호제마다 세포막을 통과하는 속도가 다를 뿐 아니라 물이 막을 통과하는 속도에도 영향을 줍니다. 사람 정자에서는 22°C에서 글리세롤을 쓸 때 물의 막 통과 속도가 DMSO를 쓸 때보다 약 세 배, 에틸렌글리콜을 쓸 때는 글리세롤을 쓸 때보다 약 세 배 빠릅니다 [BIOLOGY OF REPRODUCTION; Gilmore, JA; 53(5):985–995 (1995)]. 온도가 낮아질수록 물과 동결보호제 모두 세포막을 더 느리게 통과합니다.

저온생물학에서 가장 흔하게 쓰이는 동결보호제와 농도는 아마 DMSO 10%일 것입니다. DMSO 10%를 사용하는 절차는 골수에서 제대혈 줄기세포까지 적용되었습니다 [CRYOBIOLOGY; Hunt, CJ; 46(1):61–75, 76–87 (2003)]. 흔한 절차는 0°C부터 −30~−40°C 사이의 특정 급속 침지 온도까지 DMSO 10%에 최적인 속도로 냉각하고, 그 온도에서 시료를 액체질소에 담그는 것입니다. 세포외 얼음이 생기고 탈수되는 세포 안으로 DMSO가 확산하면, 침지 온도에서 세포 안의 DMSO 농도는 약 40%가 될 수 있습니다.

동물 장기의 유리화에는 어느 정도 성공했지만, 많은 저온생물학자는 여전히 단일 세포의 동결보존에도 어려움을 겪고 있습니다. 물고기 난자, 즉 난모세포는 지방 함량이 높고 크기가 커 특히 어렵습니다. 크기가 크면 세포 부피에 비해 확산에 사용할 수 있는 표면적이 작아 동결보호제를 넣기가 어려워집니다. 구의 표면적은 S = 4πr², 부피는 V = (4/3)πr³이므로 표면적과 부피의 비율 S/V는 반지름 r에 반비례합니다. 다시 말해 반지름이 커질수록 부피에 대한 표면적의 비율은 작아집니다.

제브라피시 배아도 결빙을 이용한 동결보존의 주요 연구 대상입니다. 제브라피시는 척추동물의 발생과 유전학을 연구하는 모델 생물이 되었습니다. 하지만 배아는 물과 동결보호제에 대한 투과성이 낮으며, 아직 성공적으로 동결보존된 적이 없습니다. 반면 굴과 성게 등 다른 해양 생물의 배아에는 결빙 방식의 동결보존이 성공적으로 적용되었습니다.

[2004년 당시의 저온생물학 연구 수준을 정리한 책으로 《LIFE IN THE FROZEN STATE》가 있습니다.]

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III. 유리전이온도까지의 냉각

생물학적 세포·조직·장기에 높은 농도의 동결보호제를 사용하면, 극저온까지 냉각할 때 얼음 결정이 형성되는 결빙 대신 유리화로 유리질 고체가 될 수 있습니다. 유리전이온도(T_g)에서 시럽 같은 액체가 유리질 고체로 변하는 과정은 점도의 급격한 증가로 정량화할 수 있습니다. T_g에서 점도는 약 10¹²파스칼·초 또는 이에 해당하는 10¹³푸아즈입니다. 10푸아즈가 1파스칼·초이기 때문입니다. [점도 단위 푸아즈는 현재는 오래된 CGS 단위계의 유산으로, 다인/cm²에 초를 곱한 값이지만 여전히 널리 사용됩니다.] 냉각 속도를 10배 높이면 T_g가 3~5°C 올라갈 수 있으므로, T_g는 녹는점 T_m보다 덜 정확하게 정해집니다. 천천히 냉각하면 분자들이 ‘자유 부피’를 최소화할 시간이 생깁니다. 실리카(SiO₂)처럼 ‘강한 유리 형성 물질’로 분류되는 액체는 T_g에서 점도 변화가 작지만, 고분자처럼 ‘취약한’ 액체는 T_g에서 점도가 크게 변합니다 [NATURE 410:259–267 (2001-03-08)].

T_g에서 특징적인 변화를 보이는 다른 두 변수는 비체적과 비열용량입니다. 비체적은 단위 질량당 부피로, 국제단위계에서는 m³/kg입니다. 여기서 ‘비’는 ‘몰당’이 아닌 ‘단위 질량당’을 뜻합니다. 대부분의 물질은 온도가 내려가면 비체적도 감소합니다. T_m에서는 비체적이 뚜렷하게 급감한 뒤, 온도가 더 내려갈 때 비체적 감소 속도도 확연히 느려집니다. 반면 T_g가 나타나는 온도 범위에서는 비체적 감소 속도만 변합니다.

T_g에서는 온도 하강에 따른 비열용량 감소 속도에도 뚜렷한 변화가 나타납니다. 비열용량은 단위 질량의 온도를 한 단위 바꾸는 데 더하거나 제거해야 하는 열량입니다. 물질 1몰의 온도를 한 단위 바꾸는 데 필요한 열량인 몰열용량과 구별됩니다. ‘비열용량’은 보통 ‘비열’ 또는 ‘열용량’으로 줄여 부릅니다. 기체의 온도는 열뿐 아니라 압축에 의한 일로도 바꿀 수 있으므로 ‘비에너지용량’이 더 정확한 용어일 것입니다. 액체 물은 대부분의 물질에 비해 비열용량이 매우 높습니다. 물의 비열용량은 kg·K당 4.2킬로줄로 구리의 열 배가 넘습니다. 원래 칼로리는 14.5°C의 물을 1°C 데우는 데 필요한 열량으로 정의했지만, 현재는 1칼로리를 4.184줄로 정의합니다. 글리세롤의 비열용량과 열전도율은 모두 물의 약 절반입니다.

지구 바닷물의 높은 비열용량은 지구에서 온도가 크게 변하는 일을 막습니다. 동물 조직에도 물이 많이 들어 있어 덥거나 추운 환경에서 온도가 급변하지 않도록 보호합니다. 신선한 소고기에서 물을 제외한 고형 부분의 비열용량은 0.84이고, 수분을 합친 소고기 전체의 비열용량은 3.14입니다. 이는 크라이오닉스 환자의 비열용량을 대신하는 값으로 사용할 수 있습니다. 글리세롤과 비슷한 동결보호제의 비열용량은 약 2.4입니다. 동결보호제와 환자의 비열용량, 그리고 온도가 낮아지며 비열용량이 감소하는 양상을 연구하면 크라이오닉스용 과학적 냉각 장비를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여러 동결보호제를 사용한 환자의 열전도율이 온도 하강에 따라 어떻게 변하는지도 연구해야 합니다.

모든 물질의 비열용량은 0켈빈에서 0이 됩니다. 이는 절대영도 부근에서는 아주 적은 열만으로도 물질의 온도가 크게 오를 수 있다는 뜻입니다. T_g에서 비열용량 변화율의 변화는 매우 뚜렷하여 동결보호제를 연구하는 과학자들이 T_g를 알아내는 데 사용합니다. 이러한 ‘열적 신호’를 측정하는 장비가 시차주사열량계(DSC)입니다. 대부분의 물질에서 분자량이 커질수록 T_g에서 비열용량 변화율의 변화가 커지고 T_g도 높아집니다 [PHARMACEUTICAL RESEARCH 11(1):54–59 (1994)].

[T_g에 관한 더 자세한 논의는 「크라이오닉스의 유리화」와 「취약성이여, 그대의 이름은 유리」를 참고하세요.]

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IV. 유리화를 위한 임계 냉각 속도

극저온은 포유류 조직을 수백 년, 어쩌면 수천 년 동안 거의 변하지 않은 상태로 보존할 수 있습니다 [AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY; Mazur, P; 247(3 Pt 1):C125–C142 (1984)]. 그러나 극저온보다 높은 온도에서 유리화해 고체 상태가 되더라도, 온도가 높으면 유리화된 조직에서 손상을 일으키는 화학반응이 계속 일어날 수 있습니다 [PHARMACEUTICAL RESEARCH; Streefland, L; 15(6):843–849 (1998)].

크라이오닉스 환자를 10°C에서 −196°C까지 얼마나 빨리 냉각해야 할까요? 과학적으로 답하려면 관련 물질인 물, 동결보호제, 생물학적 조직의 성질을 살펴보는 것이 유용합니다. 정제하지 않은 물은 물론 0°C 부근에서 얼지만, 크라이오닉스 연구자들이 피하거나 최소화하려는 현상이 바로 결빙입니다. 목표는 얼음 결정의 기계적 손상을 피하기 위해 가능한 한 많은 부분을 결정성 고체가 아닌 유리질 고체로 만드는 것입니다. 물을 초당 약 300만 °C의 속도로 약 −138°C까지 냉각하면 유리화할 수 있지만 [JOURNAL OF MICROSCOPY 143(Pt 1):89–102 (1986)], 크라이오닉스에서는 비현실적인 속도입니다. 다행히 동결보호제가 들어 있는 용액을 결정이 아닌 유리질 고체로 만드는 데 필요한 냉각 속도는 순수한 물보다 훨씬 낮습니다. 얼음 형성을 막고 유리화를 이루는 가장 느린 냉각 속도를 임계 냉각 속도라고 합니다. [유리화 과정은 「크라이오닉스의 유리화」와 「야금학과 세라믹에서 크라이오닉스가 얻는 교훈」 참고.]

순수한 물처럼 글리세롤도 어는점이 0°C에 가깝지만, 글리세롤과 물을 섞으면 더 낮은 온도에서 업니다. 중량비 50% 글리세롤 용액의 어는점·녹는점 T_m은 −23°C입니다. 어는점이 가장 낮은 혼합물은 글리세롤이 대략 66%인 것으로, 약 −46°C에서 업니다. 그러나 많은 크라이오닉스 연구자는 글리세롤·물 혼합물의 결빙보다 훨씬 나은 결과를 기대합니다. 더 중요한 것은 유리전이온도 T_g, 즉 동결보호제와 물의 혼합물이 시럽 같은 액체에서 단단한 유리질로 변하는 온도입니다. 글리세롤 혼합물의 T_g는 약 −110°C입니다. 온도가 낮아질수록 물·글리세롤 혼합물의 점도가 높아지고 결정핵이 없으면, 혼합물은 어는점 아래로 내려가도 얼지 않고 과냉각될 수 있습니다. 유리화하는 물질에서 켈빈 단위의 T_g는 대체로 T_m의 약 3분의 2입니다. 글리세롤·물 혼합물을 임계 냉각 속도보다 빠르게 식히면 더 높은 온도에서 어는 대신 T_g에서 유리화합니다.

글리세롤 50% 용액의 임계 냉각 속도는 분당 100°C입니다. 분자량이 낮은 폴리에틸렌글리콜, 즉 분자량 400g/mol인 PEG400을 중량비 6% 첨가하면 글리세롤 44% 용액의 임계 냉각 속도를 분당 50°C로 낮출 수 있습니다. 그러나 2,3-부탄다이올(2,3-BD)은 글리세롤보다 훨씬 유리화하기 쉬운 동결보호제입니다. 2,3-BD가 28.8%에 불과한 용액의 임계 냉각 속도는 분당 270°C이지만 PEG400을 첨가하면 분당 20°C로 내려갑니다 [CRYOBIOLOGY 29(5):585–598 (1992)]. 다만 2,3-BD는 독성이 강해 21st Century Medicine(21CM)의 연구자들은 유리 형성 능력이 더 약하더라도 독성이 낮은 동결보호제를 높은 농도로 사용하는 편을 선호했습니다. 분당 20°C의 냉각 속도조차 크라이오닉스 현장에서 구현하기에는 너무 빨랐습니다.

M22와 CI-VM-1처럼 유리화 능력이 더 강한 용액은 실제로 달성 가능한 냉각 속도에서도 유리화를 가능하게 했습니다. 저온생물학자들도 비슷하게, 배아와 난모세포의 동결보호제 농도를 낮춰 독성을 줄이는 대신 냉각 속도를 높여 유리화에 성공했습니다. 동결보호제 속 시료의 부피가 작을수록 큰 시료보다 빨리 냉각할 수 있습니다 [MOLECULAR AND CELLULAR ENDOCRINOLOGY; Arav, A; 187(1–2):77–81 (2002)].

크라이오닉스에서 글리세롤을 사용하던 시절에는 가능한 한 빨리 예상 글리세롤 농도의 어는점까지 냉각하는 것이 바람직했습니다. 그 어는점은 −46°C보다 낮지 않습니다. 세포 안의 결빙이 세포 밖보다 훨씬 해로우므로, 사용한 글리세롤 농도에 해당하는 어는점 아래에서는 물이 세포 밖으로 확산해 세포외에서 얼 시간을 주기 위해 분당 1.0°C보다 빠르게 냉각해서는 안 되었을 것입니다. 더 느린 냉각은 동결보호제 독성과 결정화 위험 사이의 절충입니다.

진동하는 전기장은 크라이오닉스나 저온생물학에 적용된 적은 없지만 빠른 냉각 중 얼음 형성을 줄일 수 있습니다. 진동 전기장을 이용해 에틸렌글리콜(EG) 시료 1.5마이크로리터를 액체질소에 담글 때 생기는 얼음을 줄인 사례가 있습니다. 3.5M EG 용액에서 얼음 형성량은 약 56%, 4.5M EG 용액에서는 약 66% 줄었습니다 [CRYOBIOLOGY; Jackson, JH; 34(4):363–372 (1997)].

그러나 몸속에 언제나 핵생성 물질이 있는 크라이오닉스 환자에게 유리화용 동결보호제를 사용한다면, 얼음 형성을 막기 위해 가능한 한 빨리 유리전이온도 T_g까지 냉각해야 합니다. 순수한 유리화 용액이라면 그렇게 빠른 냉각이 필요하지 않을 수 있지만, 환자의 관류가 완벽할 수 없어 여러 조직에는 농도가 더 낮은 동결보호제가 존재할 것이기 때문입니다. 다만 T_g에 가까워질 때 동결보호제 용액의 점도가 지수적으로 높아지는 현상은 T_g 부근의 결정화 위험을 크게 줄입니다 [ANNALS OF BIOMEDICAL ENGINEERING; Rabin, Y; 33(9):1213–1228 (2005)].

유리전이온도 바로 아래에서는 열응력으로 인한 균열을 막도록 냉각 속도를 빠르게 낮춰야 합니다. T_g 바로 아래에서 잠시 유지하면 다시 냉각하기 전에 열응력을 완화하는 어닐링이 가능합니다. 이후에는 열응력으로 균열이 생기지 않을 만큼 천천히 냉각해야 합니다. 이론적으로는 충분히 느린 냉각으로 균열을 막을 수 있지만, 수소결합은 쉽게 끊어지므로 균열을 막는 속도로 냉각하는 데 몇 달이 걸릴 수 있어 실용적이지 않습니다. 그래서 크라이오닉스 환자는 약 일주일에 걸쳐 액체질소 온도까지 냉각합니다. 크라이오닉스 연구소에는 냉각 절차의 각 단계를 미리 설정할 수 있는 컴퓨터 제어 냉각 상자가 있습니다.

21st Century Medicine의 M22 유리화 용액 [CRYOBIOLOGY 48:157–178 (2004)]은 순수한 동결보호제 2리터를 18시간 동안 분당 0.15°C로 냉각해도 얼음 형성 위험 없이 과냉각을 견디는 것으로 확인되었습니다. 분당 0.10°C가 되어야 비로소 소수의 얼음 결정이 관찰되었습니다. M22 10mL 시료에서는 분당 0.4°C의 임계 재가온 속도만으로도 탈유리화를 막을 수 있었습니다. [임계 재가온 속도와 탈유리화 문제의 자세한 내용은 「탈유리화 문제」 참고.]

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V. 크라이오닉스의 냉각 방법

물체를 데우거나 식히는 열전달 방식은 전도와 복사, 두 가지입니다. 전도는 운동에너지가 큰 분자와 인접한 에너지가 작은 분자의 운동학적 상호작용으로 열에너지가 전달되는 것입니다. 온도는 분자의 운동에너지를 나타내는 척도입니다. 복사는 전자기파, 즉 광자로 에너지가 전달되는 것입니다. 마이크로파는 표면 아래 깊은 곳까지 침투할 수 있다는 점에서 우수한 가열 수단입니다. 표면에서부터 전도로 열이 이동하는 것과 달리 내부 온도를 비교적 고르게 올립니다. 저는 오래전부터 표면 전도 대신 환자를 고르게 식힐 수 있는 ‘역방향 마이크로파’를 꿈꾸어 왔습니다.

크라이오닉스에서는 전도와 유체의 운동이 결합한 대류로 환자를 냉각합니다. 대류에서는 빠르게 순환하는 액체나 기체가 환자 같은 고체 표면의 전도층에서 열을 실어 나릅니다. 차가운 바람을 맞는 사람은 뒷면보다 앞면이 빨리 식습니다. 움직이는 공기의 대류가 주변 온도와 맞닿아 생기는 전도 효과에 더해지기 때문입니다. 최근 사망 판정을 받은 환자를 체온 37°C에서 10°C로 냉각할 때도, 얼음주머니나 정체된 얼음물보다 얼음물을 빠르게 순환시키는 편이 대류 효과 덕분에 훨씬 효과적입니다.

대류를 지배하는 식인 뉴턴의 냉각 법칙은 열전달률을 hA(T_s−T_f)로 나타냅니다. T_s는 시작 온도, 즉 환자의 머리나 몸의 온도이고, T_f는 얼음물이나 차가운 질소 기체 같은 냉각 매질의 최종 온도입니다. A는 고체의 표면적이며, h는 유체의 이동 속도와 물질의 열전도율·열용량에 따라 달라지는 변수입니다. 유체가 빨리 움직이고 열전도율이 높을수록 h가 커집니다. 법의학의 경험칙에 따르면 사람 몸은 공기 중보다 정체된 물에서 약 두 배, 흐르는 물에서 약 세 배 빨리 식습니다. 이 경험칙에는 물의 온도나 유속이 명시되어 있지 않지만, 크라이오닉스에서는 얼음물 온도에서 가능한 한 빠른 흐름이 바람직합니다.

열전도율은 물질이 열을 전달하는 능력을 수치로 나타냅니다. 열을 잘 전달하는 금속과 열전도율이 낮은 발포 폴리스티렌·스티로폼 같은 단열재를 구별할 수 있습니다. 물의 열전도율은 금속보다 낮지만 대부분의 유기 용매보다는 높습니다. 25°C에서 물의 열전도율은 0.61W/(m·K)로, 글리세롤의 0.29와 에틸렌글리콜의 0.26보다 두 배 이상 높고 질소 기체의 0.026보다 20배 이상 높습니다. 체온 37°C에서 0°C까지 내려가면 물의 열전도율은 0.625에서 0.561W/(m·K)로 10% 넘게 떨어집니다.

뉴턴의 냉각 법칙에 따르면 T_s가 T_f보다 훨씬 높은 냉각 초기에 속도가 가장 빠르고, 이후에는 지수적으로 느려집니다. 이는 크라이오닉스에 이상적입니다. 온도가 10°C 낮아질 때마다 대사율은 절반으로 떨어지며, 냉각으로 지질 과산화가 감소하는 정도는 대사율 감소보다도 큽니다. 저빌쥐 실험에서는 온도를 37°C에서 31°C로 낮추자 뉴런이 허혈을 견디는 시간이 거의 세 배가 되었습니다 [CRITICAL CARE MEDICINE; Takeda, Y; 31(1):255–260 (2003)]. 쥐의 뇌 조직에 두 시간의 허혈을 일으킨 실험에서는 재관류 시작 한 시간 뒤부터 체온을 단 4°C 낮춰 다섯 시간 유지하자 신경학적 결손이 유의하게 줄었습니다 [STROKE; Kollmar, R; 33(7):1899–1904 (2002)]. 돼지 안구는 사망 후 처음 13시간 동안 지수함수형 냉각 곡선을 보였습니다 [EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY; Kaliszan, M; 90(5):727–738 (2005)].

하지만 뉴턴의 냉각 법칙만으로는 크라이오닉스 환자의 냉각, 특히 법적 사망 직후의 가장 중요한 초기 단계를 충분히 설명할 수 없습니다. 심장이 멈춘 뒤에도 대부분의 체세포는 한동안 대사를 계속하며 열을 만듭니다. 피부와 피하지방은 단열 효과가 좋습니다. 몸에 수분이 많더라도 체조직의 열전도율은 순수한 물보다 낮습니다. 심정지 당시 체온이 정상이고 주변 공기 외에 별도의 냉각 매질이 없다면, 시신은 실온으로 지수적으로 식기 전에 정상 체온에 가까운 평탄 구간을 한동안 보이기 쉽습니다. 똑바로 누운 사람은 체표면의 80%가 냉각에 노출되지만 태아 자세를 취하면 약 60%만 노출됩니다. 이상적으로는 법적 사망 직후 환자를 얼음물에 담그고 심폐 장치로 대사를 지원하지만, 열을 생산하는 대사가 만든 열적 관성에도 맞서야 합니다.

세포 대사와 열 생산은 법적 사망 직후에 가장 활발하므로, 초기의 냉각 저항은 S자형 곡선을 만듭니다. 처음에는 뉴턴 법칙을 따르지 않는 평탄 구간이 나타나다가 점차 뉴턴 법칙에 가까운 냉각으로 바뀝니다 [FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL; Henssge, C; 38(3–4):209–236 (1988); Karhunen, PJ; 176(2–3):e17–e22 (2008)]. 다행히 뇌의 온도 유지 구간은 몸 전체에서 관찰되는 것의 약 3분의 1에 불과합니다 [FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL; Al-Alousi, LM; 125(2–3):237–244 (2002)].

유리화용 동결보호제 관류를 마친 환자를 보통 0°C 부근에서 유리화 보호제의 T_g인 약 −125°C까지 냉각할 때는 뉴턴의 냉각 법칙이 더 직접적으로 적용됩니다. 이 온도에서는 대사가 만들어 내는 열에 의한 열적 관성이 거의 없습니다. 그러나 유리화할 수 있는 큰 시료인 환자를 더 빨리 냉각하려고 냉각 매질의 온도 T_f를 T_g 아래로 낮추면 표면 균열 가능성이 커집니다 [CRYOBIOLOGY 27(5):492–510 (1990)].

Alcor는 수년간 약 −100°C까지 액체로 남는 실리콘 오일인 폴리다이메틸실록산, 즉 디메티콘으로 환자를 냉각했습니다. 이 무독성 물질은 욕실 틈새를 메우는 실리콘이나 샴푸의 점도를 높이는 데 쓰이는 물질과 비슷합니다. 붕산(H₃BO₃)을 넣으면 ‘실리 퍼티’ 같은 물질이 됩니다. Alcor는 실리콘 오일 욕조에서 환자의 뇌 중심부 온도와 표면 온도의 차이가 10°C를 유지하도록 냉각했으며, 그 속도는 분당 약 0.1°C였습니다. 이 속도는 글리세롤·물 혼합물이 얼면서 생기는 응력 일부를 완화했을 수 있습니다. 실리콘 오일이 매우 비싸기 때문에 Alcor는 석고 가루인 황산칼슘으로 물과 오염 물질을 침전시켜 재사용했습니다. 더 우수한 동결보호제 혼합물과 얼음 형성 억제제를 사용한 뒤에는 머리만 보존하는 Alcor 환자에게 얼음이 거의 형성되지 않는 것으로 여겨집니다. 따라서 이들 환자에게서는 T_g 위에서 응력에 의한 균열 손상 문제가 없어졌습니다. 더 중요한 점은 유리화에서는 결빙 중 세포 안팎의 동결보호제 농도가 삼투 작용으로 같아질 때까지 기다릴 필요가 없어 냉각을 더 빨리 할 수 있다는 것입니다.

현재 Alcor와 크라이오닉스 연구소는 액체질소 증기를 사용한 대류 냉각으로 머리를 분당 0.4°C가 넘는 속도로 T_g에 가까운 온도까지 냉각합니다. 기체의 빠른 흐름은 질소 기체의 낮은 열전도율과 열용량을 보완할 수 있습니다. 증기의 온도가 T_g 아래가 아니라면 환자의 표면이 먼저 고체로 굳어 응력과 균열을 일으키는 일을 막을 수 있습니다. [크라이오닉스 연구소의 냉각 상자는 「CI의 컴퓨터 제어 냉각 상자」 참고.]

21CM은 분당 1°C 미만의 속도에서도 유리화할 수 있는 동결보호제 혼합물을 발견했습니다. 그러나 외부에서 냉각하는 어떤 방법도 전신 환자의 내부를 분당 약 0.2°C보다 훨씬 빠르게 식힐 수 없으므로, 현재의 동결보호제 혼합물과 외부 냉각으로는 전신 환자를 유리화하기 어렵습니다. 머리만 보존하는 환자의 내부도 외부 냉각으로 분당 1°C보다 훨씬 빠르게 식힐 수는 없지만, 이 속도는 유리화를 가능하게 하기에는 가까스로 충분합니다.

점도가 극히 낮고 최소한 −100°C까지 액체로 남는 과불화탄소를 사용하면 더 빠른 냉각이 가능할 수 있습니다. 환자의 표면에서 내부까지 열이 느리게 전도되기를 기다리는 대신 차가운 과불화탄소를 혈관으로 관류할 수 있습니다. Mike Darwin의 동물 실험에서는 전신 냉각 속도가 0°C에서 분당 9°C, −90°C에서는 분당 1°C로 계산되었습니다. 뇌에서는 각각 분당 50°C와 5°C였습니다. 다만 과불화탄소가 일부 혈관의 동결보호제 용액을 밀어내면 그 혈관에서는 자유롭게 순환하는 반면 다른 혈관은 보호제로 막힌 채 남을 수 있어 냉각이 완전히 균일하지 않을 수 있습니다. 큰 장기와 조직의 과불화탄소 냉각을 다룬 미국 특허 6,274,303은 점도가 차례로 낮아지는 과불화탄소를 연속해서 사용하면 이 문제를 막을 수 있다고 제안합니다. 이 특허는 혈관 과불화탄소 냉각이 외부 냉각보다 열 배 빠르다고 주장합니다.

법적 사망 순간의 체온에서 환자를 처음 냉각하는 과정은 허혈 손상을 줄이는 데 매우 중요합니다. 환자를 얼음으로 둘러싸는 방법의 냉각 속도는 분당 0.064°C를 넘지 않으며, 20°C까지 식히는 데 6~8시간이 걸립니다. 흉부 압박 장치인 섬퍼와 얼음물 욕조를 쓰면 15°C까지 식힐 수 있고, 물을 순환시키는 스퀴드 장치를 더하면 2시간을 조금 넘겨 10°C까지 냉각할 가능성이 있습니다. 환자 A-1049의 체중은 다른 두 환자의 3분의 2였으므로 더 빨리 냉각되었을 것입니다. 심폐우회로 차가운 혈액 세척액을 환자 내부에 순환시키면 냉각 시간을 한 시간으로 줄일 수 있지만, 수술에 30분이 필요하고 그 사이 많은 허혈 손상이 일어납니다. 2011년 CI KOREA는 Life Extension Foundation의 지원을 받는 캘리포니아 기업 Critical Care Research가 개발한 폐 세척 냉각 시스템을 현장에 적용할 준비가 되었다고 발표했습니다. 폐는 테니스 코트 정도의 표면적을 지녀 가스 교환뿐 아니라 열 교환에도 효율적입니다. 차가운 과불화탄소를 폐에 재순환시키면 환자를 분당 1.2°C로 냉각할 수 있습니다. 과불화탄소 폐 세척에 섬퍼와 얼음물 욕조를 결합하면 심폐우회 냉각에 수반되는 수술 지연 없이 30~45분 만에 5°C까지 식힐 수 있습니다.

‘역방향 마이크로파’와 어느 정도 비슷한 효과는 단열 탈자를 이용하면 가능할 수도 있습니다. 자기장 안에서 동결보호제뿐 아니라 철 암모늄 명반 같은 상자성 염을 포함한 용액을 환자에게 관류할 수 있습니다. 자기장의 세기를 서서히 줄이면 염 이온의 배열이 무질서해지면서 표면에만 국한되지 않고 환자의 몸 전체에서 고르게 열을 흡수합니다. 이 방법이나 다른 새로운 냉각 방식은 큰 생물학적 시료를 빠르게 냉각하는 문제를 해결하는 데 큰 도움이 될 수 있습니다.

완전히 유리화하지 않아도 구조적 손상을 견딜 만한 수준으로 억제할 가능성은 있습니다. 황소 정자는 상업적으로 5°C에서 −100°C까지 임계 냉각 속도보다 훨씬 느린 분당 15°C로 냉각한 뒤 액체질소에 담가 보존합니다. 이때 이당류인 자당과 트레할로스로 막을 보호합니다 [CRYOBIOLOGY 37(3):219–230 (1998)]. 정자를 대량 사용하는 경우 모두가 살아남지 않아도 절차는 실용적일 수 있습니다. 어느 정도 결빙을 허용하는 저온생물학에서는 너무 느리거나 빠르게 냉각된 세포가 손상되는 역 U자형 생존 곡선이 나타납니다 [FERTILITY AND STERILITY 60(5):911–918 (1993)].

너무 빠르게 얼리면 물이 세포에서 확산해 나와 세포 밖에서 얼 시간이 부족합니다. 가장 큰 손상을 일으키는 것은 세포내 결빙입니다. 다만 빨리 얼릴수록 생성되는 얼음 결정은 작아져 손상도 줄어듭니다. 음식을 지나치게 천천히 얼리면 큰 결정이 세포벽을 손상시켜 질감이 나빠지고 본래의 수분이 빠져나옵니다.

수년간 많은 크라이오닉스 연구자는 3.72M 글리세롤, 즉 27.2% v/v가 최적이라고 믿었습니다. 세포외 공간의 물 60%는 얼게 하면서 세포 안의 물은 유리화할 수 있다는 생각이었습니다. 광학현미경 결과는 이 이론을 뒷받침하는 듯했지만 이후 전자현미경 결과가 이를 반박했습니다. 그 뒤 일부 크라이오닉스 단체는 가능한 한 높은 글리세롤 농도, 즉 7M을 조금 넘는 농도에서 더 좋은 결과를 얻었습니다. 이전에는 글리세롤 농도가 지나치게 높으면 세포막이 녹는다고 잘못 믿었던 연구자들도 있었습니다. 물에 섞인 글리세롤은 68% v/v, 즉 9M을 조금 넘는 농도에서 유리화하지만 점도가 너무 높아 환자에게 55% v/v 또는 7.5M을 훨씬 넘는 농도까지 투입할 수는 없습니다. 따라서 글리세롤을 동결보호제로 사용할 때는 고화 온도까지 분당 약 0.5°C로 냉각하고 이후 더 낮은 온도까지는 분당 0.1~0.2°C로 냉각해야 합니다. 고화 온도에 빨리 도달할수록 동결보호제 독성, 허혈 손상 및 다른 바람직하지 않은 반응이 일어날 시간이 줄고 더 낮은 고화 온도까지 과냉각될 가능성은 커집니다. 그러나 분당 0.5°C보다 빨리 냉각하면 세포가 충분히 탈수되지 않아 세포외 결빙 대신 해로운 세포내 결빙이 생길 수 있습니다.

환자를 액체질소와 함께 운송하는 것은 실행하기 어렵지만, 크라이오닉스에 사용되는 유리화 용액은 보통 충분히 안정적이어서 유리화한 환자를 드라이아이스 온도에서 운송할 수 있습니다. 승화 온도에서 드라이아이스의 밀도는 물 얼음보다 약 1.5배 높지만, 물 얼음의 비열용량은 드라이아이스의 약 두 배입니다. 이 사실만 보면 물 얼음을 드라이아이스 온도까지 식혀 운송하는 편이 나아 보일 수도 있습니다. 그러나 그러면 드라이아이스의 승화잠열이 주는 냉각 효과를 빠뜨리게 됩니다. 따라서 드라이아이스 운송이 선호됩니다. 운송 용기에는 승화한 이산화탄소가 어느 정도 빠져나갈 수 있는 통로가 있어야 합니다.

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VI. 저온에서의 응력과 변형

T_g 아래의 유리화 환자나 그보다 높은 온도에서 동결보호제·물 혼합물이 고체로 언 비유리화 환자에게는 응력이 일으키는 균열이 중요한 문제가 될 수 있습니다. 재료역학에서 응력은 고체의 단위 면적에 작용하는 힘을 나타냅니다. 기체나 액체에서 압력이 단위 면적당 힘을 나타내는 것과 같습니다. 따라서 응력과 압력은 같은 단위인 파스칼, 즉 제곱미터당 뉴턴을 사용합니다. 변형률은 응력을 받는 고체가 얼마나 늘어나는지를 나타냅니다. 다이빙대 위에 서면 응력이 생기고, 다이빙대가 휘는 모습이 변형입니다.

물질의 강성인 영률은 응력을 변형률로 나눈 값입니다. 탄성계수라고도 하지만 ‘비탄성의 정도’라고 표현하는 편이 더 적절할 수 있습니다. 변형은 압력에 의한 응력뿐 아니라 열팽창에 의한 응력에서도 생깁니다. 열팽창계수는 물질의 성질이며 얼음에서는 매우 높습니다. 얼음의 열팽창계수는 일반 유리기구에 쓰이는 소다석회유리보다 다섯 배 이상 커서 심각한 응력을 일으킬 수 있습니다. 열팽창 응력은 보통 유리기구를 가열할 때 쉽게 깨지는 주요 원인입니다. 소다석회유리의 소다(Na₂O)와 석회(CaO) 일부를 산화붕소(B₂O₃)로 바꾸면 소다석회유리의 3분의 1만큼 열팽창하는 파이렉스가 만들어져 열충격에 훨씬 잘 견딥니다. 소다석회유리의 비열용량은 파이렉스와 거의 같고 열전도율은 20% 높으므로, 열충격 저항에서 가장 큰 차이를 만드는 것은 열팽창의 차이임이 분명합니다.

온도가 내려가면 물질은 대체로 부피가 줄어드는 음의 열팽창, 즉 열수축을 보입니다. 이 현상은 한 방향의 길이 변화인 선형 열수축으로도 수치화할 수 있습니다. 예를 들어 얼음물 온도에서의 길이, 즉 원문 표기의 293K(0°C)와 비교하면 알루미늄은 200K(−73°C)에서 0.2%, 액체질소 끓는점에 가까운 80K(−193°C)에서 0.4% 수축합니다. 파이렉스는 훨씬 적게 수축해 각각 약 0.027%와 0.054%입니다. 반면 수소결합이 매우 강한 테플론은 각각 1.24%와 1.93%로 훨씬 크게 수축합니다. 나일론의 수소결합과 열수축은 아마 생물학적 조직 및 동결보호제에서 예상되는 값에 더 가까울 것입니다. [자료: 《HELIUM CRYOGENICS》 2장.]

액체질소 온도에서 구리의 열전도율은 나일론·테플론·생물학적 조직·동결보호제 같은 비결정성 비금속 물질보다 거의 네 자릿수나 높습니다. 금속의 높은 열전도율은 전자에 기인하지만 결정의 열전도율은 포논에 기인합니다. 순수 합성 다이아몬드는 전기전도율이 매우 낮은데도 격자의 포논 덕분에 열전도율이 은보다 거의 다섯 배 높습니다. 물의 열전도율은 은의 약 1,000분의 1이지만 글리세롤의 약 두 배, 고무의 약 네 배입니다. 열전도율이 낮은 물질은 단열재이며, 열팽창이 큰 물질과 마찬가지로 냉각 중 열전도율이 높은 물질보다 열응력이 더 많이 생깁니다.

물질이 균열을 견디는 능력은 연성 또는 취성에도 좌우됩니다. 얼음과 유리는 취성이 가장 큰, 곧 연성이 가장 낮은 물질에 속합니다. 연성 물질은 깨지기 전까지 취성 물질보다 훨씬 큰 소성변형을 견딥니다. 온도가 낮아질수록 거의 모든 물질은 연성이 줄고 취성이 커집니다.

환자의 표면에서 대류 냉각이 일어나고 열전도율이 낮다면 표면과 내부의 온도 차이가 열응력으로 이어져, 지나치게 빨리 냉각할 경우 결국 균열이 생길 수 있습니다. 유리는 결정성 물질보다 열전도율이 낮습니다. 그래서 유리의 열팽창이 적더라도 부분적으로 언 환자보다 완전히 유리화한 환자에게 이 문제가 더 심각할 수 있습니다.

순수한 물을 초당 약 300만 °C로 냉각하면 약 −135°C(T_gw)에서 유리화합니다. 최소 농도의 동결보호제로 T_gs에서 유리화하는 용액은 농도가 더 높으면 더 높은 온도에서도 유리화합니다. 그 온도 역시 T_gs라고 표시됩니다. 어떤 이유로 유리화 용액의 일부가 얼면 얼음, 즉 물이 제거되므로 남은 유리화 혼합물의 농도는 높아집니다. 결빙할 수 있는 최저 온도는 농도에 따라 다릅니다. 공융 농도의 용액은 공융 온도 T_u에서 업니다. [공융 농도는 「공융 혼합물의 고화」 참고.] 얼지 않은 부분의 용액에서 결빙이 일어날 수 있는 최저 온도는 녹는점 T_m′입니다.

농축되어 얼지 않은 부분의 유리전이온도를 T_g′라고 합니다. 관류가 불완전한 크라이오닉스 환자처럼 원래 유리화하려던 혼합물에 얼음이 형성되면, 얼지 않은 부분에 남은 혼합물의 농도가 높아져 T_g, 곧 T_g′가 더 높아집니다 [그림 1; CRYOBIOLOGY; Wowk, B; 60(1):11–22 (2010)]. 이는 실무적으로 중요합니다. 환자의 일부가 예상한 T_gs보다 상당히 높은 T_g′에서 유리화한다면, 열팽창률이 변하지 않은 상태에서 그 높은 T_g′에 맞춰 냉각을 늦추지 않을 경우 열응력으로 균열이 생길 수 있습니다. [T_g′는 「유리의 몇 가지 성질」 참고.]

붕사는 용질과 가교결합하여 유효 분자량을 높이고 T_g′를 올릴 수 있습니다 [CHEMICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN; Izutsu, K; 51(6):663–666 (2003)]. 붕사가 T_gs도 높이고 유리화 시료의 열팽창률도 낮춘다면 저온 균열을 줄일 수 있을 것입니다. 하지만 그 가교결합이 줄어든 균열보다 더 큰 구조 정보의 손실을 일으키지는 않을까요?

동결보호제를 넣지 않은 극저온 조직의 예비 연구에서는 신장 조직의 탄성계수가 뇌 조직의 두 배 이상, 강도는 네 배인 것으로 나타났습니다 [CRYOBIOLOGY 33(4):472–482 (1996); 34(4):394–405 (1997)]. 또 다른 예비 연구에서는 글리세롤과 DMSO를 사용하면 열팽창이 감소하는 것으로 나타났습니다 [JOURNAL OF BIOMECHANICAL ENGINEERING 120(2):259–266 (1998)].

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VII. 환자 유리화를 위한 T_g 부근의 냉각 절차

크라이오닉스 환자를 액체질소 온도까지 냉각할 때는 컴퓨터가 제어하는 냉각 상자를 사용합니다. 온도 탐침인 열전대로 냉각 상자 안의 기체 온도, 환자의 가슴 안쪽, 두개골 피부 아래 또는 비인두 깊은 곳, 즉 코 안쪽을 지나 목구멍 위쪽의 온도를 감시합니다. 가슴 탐침은 몸 중심부의 온도를 알려주고 비인두 탐침은 뇌 중심부 온도를 잘 대표합니다. 뇌 한가운데 탐침을 찔러 넣어 손상시키고 싶지는 않기 때문입니다.

한 열전대는 액체질소를 냉각 상자 안으로 방출하는 밸브가 열리는 빈도와 시간을 조절하여 냉각 속도를 제어합니다. 다른 열전대는 온도를 감시하기만 합니다. 액체질소가 기화하는 과정은 열을 흡수하는 흡열 과정이며 냉각 효과에 크게 기여합니다.

유리화를 잘하려면 관류가 끝난 뒤 가능한 한 빨리 T_g, 약 −123°C까지 냉각하는 것이 중요합니다. 빠른 냉각은 동결보호제 독성에 노출되는 시간을 줄이고 임계 냉각 속도를 넘겨 환자를 과냉각함으로써 얼음 형성을 피하게 합니다.

초기 냉각 단계에는 어느 열전대를 제어용으로 사용하든 냉각 상자의 액체질소 조절 밸브가 사실상 계속 열려 있을 것입니다. 그러나 T_g에 접근할 때 깊숙한 곳에 있는 열전대를 제어용으로 사용하면 표면에 가까운 조직이 목표보다 훨씬 낮은 온도까지 냉각될 수 있습니다. 표면의 낮은 온도가 중심부로 전도되기까지 시간이 걸리므로 뇌 중심부, 특히 몸 중심부의 온도는 표면보다 훨씬 느리게 내려갑니다. 따라서 중심부나 목·인후 아래쪽처럼 중심부에 가까운 온도를 제어 기준으로 삼으면 얕은 조직은 과도하게 냉각됩니다. 이는 처음 냉각이 가장 빠를 때 특히 그렇습니다. 반대로 주변 기체 온도를 액체질소 분사 밸브의 제어 기준으로 삼으면 밸브가 자주 열리고 닫혀 온도가 과하게 출렁일 수 있습니다.

제어용 열전대는 T_g 바로 위까지 냉각되도록 해야 합니다. T_g 바로 위에서는 핵생성 속도가 매우 높지만 결정 성장 속도는 매우 낮습니다. 따라서 충분히 관류된 환자라면 T_g 바로 위에 잠시 두어도 안전합니다. 허혈·부종·뇌졸중·동맥경화 때문에 관류가 불량한 환자라면 T_g 부근에 머물러 결빙 위험을 감수하기보다 빨리 그 아래로 내려가 균열 위험을 감수하는 편이 나을 수 있습니다. T_g 아래로 냉각할 때는 환자의 머리 안에 온도 차이가 거의 없어야 합니다. 온도가 고르지 않은 것이 T_g 아래에서 균열을 일으키는 열응력의 가장 큰 원인이기 때문입니다.

크라이오닉스에 사용하는 동결보호제의 T_g는 약 −123°C입니다. 유리화된 사람 뇌는 −123°C 아래로 내려가기 전까지 고체 유리가 되지 않지만, 그보다 높은 온도에서도 점도가 매우 높아 응력 완화가 상당히 이루어질 수 있습니다. 따라서 유리화된 뇌를 가진 환자를 −100°C, −110°C, −120°C에서 각각 24시간 유지하면 응력을 상당히 완화할 수 있습니다. 보고에 따르면 한 환자는 −110°C에서 석 달 보관한 뒤 거의 −140°C가 되어서야 균열이 생겼지만, −110°C에서 한 달만 보관한 환자는 그보다 훨씬 높은 온도에서 균열이 생겼습니다.

세 번째 유지 단계인 −120°C를 마친 뒤에는 환자를 30분에 걸쳐 −118°C로 조금 데우고 그 온도에서 두 시간 유지하여 어닐링할 수 있습니다. 높은 온도에서 확산이 더 활발해져 응력이 완화되고 표면 온도도 중심부 온도에 가까워집니다. 온도가 더 균일할수록 열응력은 줄어듭니다.

유리화 가능한 농도의 프로필렌글리콜(T_g −108°C)을 사용한 실험에서는 482mL 시료를 매우 느리고 균일하게 냉각해도 T_g보다 25°C 이상 낮은 −132°C 아래에서는 균열을 막지 못했습니다 [CRYOBIOLOGY; Fahy, GM; 27(5):492–510 (1990)]. 액체질소 온도인 −196°C에 접근하면 손상이 더 커질 것입니다. 하지만 새로운 유리화 용액으로 토끼 신장과 토끼 반쪽 뇌를 균열 없이 액체질소 온도까지 냉각한 사례도 있습니다. 그 결과를 더 큰 시료에 그대로 기대할 수는 없습니다. 같은 냉각 속도라면 부피가 큰 시료는 작은 시료보다 더 높은 온도에서 깨집니다 [위 논문 표 2].

모든 금속에는 그보다 빨리 냉각하면 균열을 유발하는 응력이 생길 수 있지만, 천천히 냉각하면 균열이 생기지 않는 속도가 있습니다. 유리나 세라믹도 원리상 다르지 않을 이유가 없으며 유리화 장기는 상당히 균일합니다. 핵심 차이는 금속과 비생물학적 유리조차 생물학적 동결보호제가 만드는 유리보다 더 강한, 보통 공유결합으로 결합한다는 것입니다. 수소결합은 더 쉽게 끊어지므로 환자를 액체질소 온도까지 냉각하면서 열응력에 의한 균열을 완전히 막으려면 시간당 몇 천분의 1°C 수준으로 냉각해야 할 수도 있습니다. 이는 실용적인 방법으로 달성할 수 없는 속도입니다.

유리화된 사람 뇌를 액체질소 온도까지 식힐 때 균열이 불가피하다면, 오히려 더 높은 온도에서 균열을 유도하는 편이 좋습니다. 높은 온도에서 생긴 균열은 수가 적고 넓지만, 낮은 온도가 되어서야 균열이 생기면 매우 작고 많은 균열로 나뉘어 손상이 더 커집니다 [그림 8; CRYOBIOLOGY; Fahy, GM; 27(5):492–510 (1990)]. 따라서 다음 단계는 분당 약 1°C로 −145°C까지 다소 빠르게 냉각해 높은 온도에서 균열을 유도하는 것입니다.

높은 온도에서 균열을 유도해도 낮은 온도에서 균열이 생길 가능성을 없앨 수는 없지만 줄일 수 있습니다. 이후 −196°C까지는 선형이 아닌 지수함수형으로 냉각하는 편이 열응력 균열을 줄이는 데 가장 좋습니다. 온도가 내려갈수록 열팽창률은 낮아지고 T_g에서 급격히 떨어지지만, T_g 아래에서는 응력이 대부분 풀리는 데 필요한 이완 시간이 열팽창률 감소보다도 더 빠르게 늘어납니다. 열전도율 역시 온도 하강에 따라 낮아집니다. 원래도 비결정성 비금속 물질의 열전도율은 매우 낮습니다. 그 결과 T_g 아래에서 온도를 1°C씩 내릴 때마다 열응력은 점점 더 빠르게 증가합니다. 따라서 낮은 온도로 내려갈수록 냉각 속도를 줄이는 것이 일정한 속도로 식히는 것보다 열응력을 줄입니다.

−145°C 아래에서의 지수함수형 냉각까지 포함한 사람의 전체 냉각 절차는 다음과 같을 수 있습니다.

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VIII. 액체질소 온도보다 높은 온도에서의 보관

유리화되지 않아 동결보호제·물 혼합물이 T_g보다 상당히 높은 온도에서 어는 환자에게는 T_g보다 훨씬 높은 온도에서도 내부 응력이 크게 생깁니다. 더 빠르게 냉각하면 얼음의 양과 결정 크기는 줄일 수 있지만 세포 안의 얼음과 균열의 크기는 늘릴 수 있습니다. 이론적으로는 아주 천천히 냉각해 균열을 없앨 수 있으나, 매우 느린 냉각에서도 T_g보다 약 20°C 낮아지면 균열 위험이 커집니다. 결빙이든 유리화든 환자의 몸집이 클수록 내부 응력도 커집니다. 미래의 분자 기술은 균열과 결빙을 모두 복구해야 할 것이며, 아직 가설적인 기술에 어느 정도의 균열과 결빙이 최적인지 알기 어렵습니다. 유리화하지 못했다면 필요한 기술이 개발되기까지 오랫동안 최대한 잘 보존할 수 있도록 액체질소 온도에 보관하는 편이 가장 신중해 보입니다. 액체질소 온도 보관은 그보다 높은 극저온에서의 보관보다 방사선 손상에도 덜 취약할 것입니다. [「극저온에서의 방사선 손상」 참고.]

유리화된 크라이오닉스 환자는 균열이나 파열을 피하려면 장기 보관 온도를 T_g 부근으로 유지해야 할 수도 있다는 가정에 따라, Timeship 프로젝트의 엔지니어들은 더 높은 극저온을 저렴하면서도 안정적으로 유지할 수 있는 보관 장치를 설계했습니다. Timeship 보관 시설을 사용할 수 있게 되면 모든 크라이오닉스 단체의 회원에게 개방될 것으로 예상됩니다. Alcor는 일부 머리 보존 환자를 위한 중간 극저온 보관을 제공하지만, 액체질소 보관보다 비용이 훨씬 높습니다.

[극저온에서 분자의 이동 가능성에 관한 몇 가지 추론은 「저온에서의 분자 이동성」 참고.]

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